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Bisulfit-Umwandlung genomischer DNA: Eine Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung in genomischen DNA-Proben aus gastrointestinalem Krebsgewebe

30. April 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Bonetto, A. et al. Die tumortragende Maus des Dickdarm-26-Karzinoms als Modell für die Untersuchung der Krebskachexie. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt das Verfahren der Bisulfit-Modifikation von genomischer DNA aus Magen-Darm-Krebsproben. Die Technik ist nützlich, um die Beziehung zwischen den Methylierungsmustern von Genen zu untersuchen und ihren Beitrag zur Krebsentstehung zu etablieren.

Protokoll

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>1. Bisulfit-Behandlung

  1. Verwenden Sie 45 μl der verdauten Gewebelösung als Probe.
  2. Führen Sie die Bisulfitbehandlung mit Reagenzien in einem Bisulfit-Umrüstsatz gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).
    1. Geben Sie 5 μl Verdünnungspuffer in die DNA-Probe und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 °C (siehe Materialtabelle).
    2. Während die Proben inkubiert werden, bereiten Sie das Bisulfit-Umwandlungsreagenz vor, indem Sie 750 μl dH2O und 210 μl Verdünnungspuffer in ein Röhrchen CT-Umwandlungsreagenz geben (siehe Materialtabelle). Mischen Sie die Röhren, indem Sie sie 10 Minuten lang vortexen.
    3. Nach der 15-minütigen Inkubation geben Sie 100 μl des vorbereiteten CT-Umwandlungsreagenzes zu jeder Probe und mischen Sie es durch Inversion.
    4. Die Proben werden im Dunkeln bei 50 °C für 12 bis 16 Stunden inkubiert.
    5. Nach der Inkubation die Proben entnehmen und 10 min auf Eis legen.
    6. Fügen Sie 400 μl Bindungspuffer hinzu und mischen Sie jede Probe durch Auf- und Abpipettieren (siehe Materialtabelle). Laden Sie jede Probe in eine Spin-Säule und legen Sie die Säule in ein 2-ml-Entnahmeröhrchen (siehe Materialtabelle).
    7. Zentrifugieren Sie jede Probe 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit (10.000 x g) und verwerfen Sie den Durchfluss.
    8. Geben Sie 200 μl Waschpuffer in jede Säule und schleudern Sie 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit, wobei der Durchfluss verworfen wird (siehe Materialtabelle).
    9. Geben Sie 200 μl Desulfonierungspuffer in jede Säule und lassen Sie die Säule 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen (siehe Materialtabelle). Drehen Sie die Säulen nach der Inkubation 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit und verwerfen Sie den Durchfluss.
    10. Geben Sie 200 μl Waschpuffer in jede Säule und schleudern Sie 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit (siehe Materialtabelle).
    11. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
    12. Geben Sie 46 μl dH2O in jede Säule und setzen Sie jede Säule in ein neues steriles 1,5-ml-Einwegröhrchen aus Polypropylen ein (siehe Materialtabelle). Drehen Sie jedes Röhrchen 2 Minuten lang, um die DNA zu eluieren.
  3. Entfernen Sie jede Schleudersäule aus der Einwegtube aus Polypropylen und entsorgen Sie sie (siehe Materialtabelle). Die DNA ist nun bereit für die Analyse.

>2. Quantitative methylierungsspezifische PCR (qMSP)

  1. Verwenden Sie die Bisulfit-modifizierte DNA aus Schritt 1.3 als Template für die fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR in qMSP, um die Methylierung der Promotorregion in jeder Genanalyse zu bewerten.
  2. Führen Sie die qMSP mit einem 96-Well-Real-Time-PCR-Gerät durch (siehe Materialtabelle).
    1. Überprüfen Sie den Promotor-Methylierungsstatus des Zielgens auf der Bisulfit-modifizierten DNA mit 200 nM Forward-Primer, 200 nM Reverse-Primer und 80 nM-Sonden. Bereiten Sie den Mastermix mit 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10 nM Fluorescein, 0,166 mM jedes Desoxynukleotidtriphosphats und 0,04 U/μl DNA-Polymerase vor (siehe Materialtabelle). Das endgültige Reaktionsvolumen in jeder Vertiefung für alle Assays beträgt 25 μl.
    2. Führen Sie den Zyklus von qMSP wie folgt durch: 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 55 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 Minute und 72 ΰC für 1 min.
      HINWEIS: Das Zielgen sollte auf der Grundlage der Kriterien ausgewählt werden, dass es größere Beta-Werte aufweist, mit CpG-Inseln in der Promotorregion zusammenhängt und für das Primer- und Sondendesign für qMSP geeignet ist.
  3. Als positive Methylierungskontrolle ist humangenomisches Präparat zu verwenden, das mit CpG-Methylase (M.SssI) behandelt wurde (siehe Materialtabelle).
    Anmerkung: Die endgültige Quantifizierung der Methylierung wird als relativer Methylierungswert (RMV) definiert und für jedes Methylierungsnachweisreplikat als 2-ΔΔCt im Vergleich zum mittleren Ct für β-Aktin (ACTB) berechnet. Die Sequenzen von Primer und Sonde sind in Tabelle 1 dargestellt. Für nicht erkannte Replikate wird ein Ct von 100 verwendet, was einen Wert von 2–ΔΔCt nahe Null ergibt. Es wird folgende Formel verwendet:
    Mittelwert 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.
GenVorwärts 5' - 3'Rückwärts 5' - 3'Sonde
B-AKTINTAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TTAAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\
EPB41L3GGG ATA GTG GGG TTG ACG CATA AAA ATC CCG ACG AAC GAAAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(NH4)2SO4Sigma-AldrichArtikel-Nr.: 14148
10% Natriumdodecylsulfat (SDS)351-032-721 EA
100% EthanolSigma-AldrichArtikel-Nr.: 24194
ABI StepOnePlus Real-Time-PCR-SystemAngewandte BiosystemeArtikel-Nr.: 4376600 96-Well-Real-Time-PCR-Gerät
Reagenz für CT-KonvertierungZymo-ForschungNr. D5001-1
Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP)InvitrogenTel.: 10297-018
DEPC-behandeltes WasserDEPC-behandeltes WasserTel.: 351-068-131
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)CorningArtikel-Nr.: 46-034-CL
EZ DNA-MethylierungskitZymo-ForschungNr. D5002
Menschliche genomische DNABiolabore in NeuenglandN4002S
Infinium Humaner Methylierungs-450-AssayIlluminaWG-314Array-Plattform zur komplexen Bewertung der DNA-Methylierung zur Beurteilung des Methylierungsstatus von >450.000 CpG-Stellen im Genom
Leichter Cycler 480Roche5015278001
M-Binding-PufferZymo-ForschungNr. D5002-3
M-Desulphonations-PufferZymo-ForschungNr. D5002-5
M-VerdünnungspufferZymo-ForschungNr. D5002-2
M-Wash PufferZymo-ForschungNr. D5002-4
Proteinase KNeuengland BiolaboreNr. P8107S
Einweg-Tube aus Polypropylen (Eppendorf)Eppendorf24533495
Trishydrochlorid (Tris-HCL) 2 M pH 8,8Qualität BiologischArtikel-Nr.: 351-092-101
Zymo Spin 1 SpalteZymo-ForschungNr. C1003
β-MercaptoethanolSigma-AldrichNr. M3148
FluoresceinBio-Rad#1708780
Platin-Taq-PolymeraseThermoFisher ScientificTel.: 10966-034

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Schlagwörter

Bisulfite ConversionDNA MethylationGenomic DNAGastrointestinal CancerMethylation AnalysisSpin Column PurificationQuantitative MSPReal time PCRMethylation ProfileCytosine Residues

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