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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Kryokonservierung von Gewebe
HINWEIS: Dieser Teil bezieht sich hauptsächlich auf die Methoden für das Live Tissue Kit Cryo Kit. Die wichtigsten Kits und Ausrüstungsgegenstände sind in der Materialtabelle aufgeführt.
- Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer IRB-zugelassenen Methode, wenn der Tumor einen Durchmesser von mehr als 10 mm hat.
- Isolieren Sie den Tumor mit einer sterilen Pinzette und einer Schere langsam von den Mäusen.
- Waschen Sie das Tumorgewebe mit DPBS in einer 10 cm großen Schüssel. Präparieren und entfernen Sie nekrotische Bereiche, Fettgewebe, Blutgerinnsel und Bindegewebe mit Pinzette und Schere.
- Schneiden Sie das Tumorgewebe mit einer Form auf maximal 1 mm Dicke zu.
- Die Scheiben mit DPBS in einer 10 cm Schüssel waschen.
Anmerkung: Bei der Vitrifikation werden in den Schritten 1.6-1.8 Röhrchen mit der Bezeichnung V1/V2/V3 verwendet. Die Hauptbestandteile sind DMSO und Saccharose.
- Übertragen Sie die Scheiben mit einer Pinzette in das Röhrchen V1 und inkubieren Sie das Röhrchen bei 4 °C für 4 min. Rollen und drehen Sie das Röhrchen kurz um und legen Sie es für weitere 4 min auf 4 °C.
- Die V1-Lösung und die Scheiben in eine 10 cm große Schüssel geben. Die Scheiben mit einer Pinzette in das Röhrchen V2 überführen und das Röhrchen V2 bei 4 °C 4 min inkubieren. Rollen Sie das Rohr kurz um, drehen Sie es um und stellen Sie es für weitere 4 min auf 4 °C.
- Die V2-Lösung und die Scheiben in eine 10 cm große Schale geben. Die Scheiben mit einer Pinzette in das Röhrchen V3 überführen und das Röhrchen 5 min bei 4 °C inkubieren. Rollen Sie das Rohr kurz um, drehen Sie es um und stellen Sie es mindestens 5 Min. bei 4 °C auf. Stellen Sie sicher, dass alle Scheiben auf den Boden des Rohrs sinken.
- Wenn noch mehrere Scheiben schwimmen, das Rohr aufrollen und kurz umdrehen und das Rohr wieder auf 4 °C stellen, bis alle Scheiben vollständig absinken; ggf. die schwimmenden Scheiben entsorgen.
- Die V3-Lösung und die Scheiben in eine 10 cm große Schüssel geben.
- Schneiden Sie die Taschentuchhalter auf die richtige Länge zu und legen Sie sie auf sterile Gaze. Übertragen Sie die Scheiben auf die Halter. Wickeln Sie die Halter mit der Gaze ein und legen Sie sie mit einer Pinzette in flüssigen Stickstoff, gefolgt von einer Inkubation von 5 Minuten.
- Beschriften Sie die kryogenen Fläschchen mit den Gewebeinformationen.
- Übertragen Sie die Halter mit Gewebescheiben in kryogene Fläschchen, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden.