Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Isolierung von LDN aus Bauchhöhlenspülungen
- Probenaufnahme
- 1.000 ml normaler steriler Kochsalzlösung vor dem Wundverschluss direkt in die Bauchhöhle infundieren bei Patienten, die sich aufgrund von gastrointestinalen Malignomen einer Bauchoperation unterzogen haben.
Anmerkung: Die Proben wurden von Patienten entnommen, die sich einer Gastrektomie, Kolektomie oder Ösophagektomie unterzogen hatten, ohne dass eine Verzerrung aufgrund von Alter oder Geschlecht erfolgte. Kochsalzlösung wurde in ein Gefäß umgefüllt und innerhalb einer Minute in den gesamten Bauch gegossen. Dies wird routinemäßig als postoperative Peritonealwäsche ohne signifikante Auswirkungen auf die Patienten durchgeführt.
- Spülen Sie die Bauchhöhle ausgiebig für mindestens 1 min.
Anmerkung: Es wird empfohlen, die infundierte Flüssigkeit langsam mit den Händen des Chirurgen zu rühren, damit die Proben gleichmäßig sind.
- 200 ml Spülflüssigkeit mit vier 50-ml-Spritzen zurückgewinnen.
Anmerkung: Manchmal wird ein Gummiverbinder verwendet, um die Flüssigkeiten aufzunehmen.
- Durchführung der Aufreinigung von peritonealer LDN mit granulozytenspezifischem mAb, CD66b
Anmerkung: Da die Zwischenschicht nach der Dichtegradientenzentrifugation viele mononukleäre Zellen enthält, wurde eine positive Selektion von polymorphen Neutrophilen mit CD66b mAb durchgeführt.
- Übertragen Sie die Peritonealspülflüssigkeit in ein 50-ml-Röhrchen.
Anmerkung: In diesem Schritt werden die Flüssigkeiten durch einen 100 μm Nylonfilter geleitet, um Verunreinigungen zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie die Peritonealflüssigkeit bei 270 x g für 7 min bei RT.
- Resuspendieren Sie die Pellets in 5 mL PBS mit 0,02 % EDTA.
- Überlagern Sie die 5 ml Zellsuspension vorsichtig mit einer 3 ml-Dichtegradientenlösung.
- Zentrifugieren Sie bei 1.700 x g für 15 min bei RT ohne Pausen.
- Ernten Sie mit einer Pipette etwa 2 bis 3 ml einer Lösung, die die Zwischenschichten enthält (Abbildung 1A), und mischen Sie sie mit 10 ml PBS mit 0,02 % EDTA.
- Die Peritonealflüssigkeit bei 400 x g für 7 min bei RT zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Weitere 10 ml PBS mit 0,02 % EDTA zugeben und bei 270 x g 7 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Lösen Sie das Zellpellet (1 x 107) in 60 μl Puffer für das magnetische Zelltrennkit auf.
- Geben Sie 20 μl Fc-Block zu den Pellets und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C.
- 20 μl des mit Mikrokügelchen konjugierten Anti-CD66b zugeben und weitere 10 Minuten bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Pellets und resuspendieren Sie sie in 500 μl MACS-Puffer.
- Die Zellsuspension wird auf eine magnetische Säule im Magnetfeld eines geeigneten Magnetseparators aufgetragen und der Durchfluss mit CD66b(-)-Zellen wird durch Waschen der Säule mit 15 mL Puffer aufgefangen.
- Nehmen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider und spülen Sie die magnetisch markierten CD66b(+)-Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
Anmerkung: Die CD66b(+)-Zellpopulation besteht hauptsächlich aus Neutrophilen, wie durch FACS-Analyse bestimmt wurde, was darauf hindeutet, dass >95% der CD66(+)-Fraktion positiv für CD11b, CD15 und CD16, aber negativ für CD14 sind.
