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>1. Färbung von Tumorzellen mit rot fluoreszierendem Zelllinkerfarbstoff
- Bereiten Sie die menschlichen Krebszelllinien MKN45, NUGC und OCUM-1 vor.
- 1 x 107 Zellen mit PBS + 0,02 % EDTA in einem 15 mL Röhrchen waschen und bei 270 x g für 7 min bei RT zentrifugieren.
- Geben Sie 1 ml Lösung zur Farbstofffärbung zu den Pellets und pipettieren Sie sie vorsichtig.
- 4 μl rot fluoreszierender Zelllinker-Farbstoff werden in 1 ml Färbelösung gelöst und mit der Zellsuspension aus Schritt 1.2 gemischt.
- Inkubieren Sie die Pellets 4 Minuten lang bei RT.
- Fügen Sie 4 ml DMEM (10 % FBS) hinzu, um die Färbereaktion zu stoppen.
- 270 x g 7 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 zweimal.
- Prüfen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregung = 551 nm, emittierend = 567 nm), ob die Tumorzellen rot gefärbt sind.
>2. Analyse der Adhäsion von Tumorzellen an NETs
- Kultivieren Sie neutrophile Zellen niedriger Dichte in einer 6-Well-Poly-L-Lysin-beschichteten Platte (6 cm Durchmesser) für 2 h bei 37 °C in 5 % CO2, was die Herstellung von extrazellulären Neutrophilenfallen oder NETs ermöglicht
- Übertragen Sie die rot fluoreszierend gefärbten Tumorzellen (1 x 106) in 1 mL RPMI 1640, ergänzt mit 0,1 % BSA.
- Fügen Sie die Tumorzellen der LDN-Kultur hinzu, die die NETs produziert hat.
- 5 min bei 37 °C inkubieren, wodurch die Tumorzellen mit den NETs in Kontakt treten können.
Anmerkung: Eine lange Inkubation induziert die Adhäsion der Tumorzellen an LDN oder an die Platten.
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Vertiefungen vorsichtig, indem Sie 2 ml vorgewärmtes Medium (0,1 % BSA + RPMI 1640) hinzufügen und die Schale schwenken.
- Wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 2.5 zweimal.
Anmerkung: Da NETs schwach an der Platte haften, sollte das Waschen so schonend wie möglich erfolgen, um ein Entfernen der NETs selbst zu vermeiden.
- Fügen Sie grünen Fluoreszenzfarbstoff zur Färbung des Zellkerns und der Chromosomen in einer Endkonzentration von 5 μg/ml hinzu, um die NETs sichtbar zu machen.
- Beobachten Sie die NETs und die angehängten Tumorzellen mit den entsprechenden Filtern (grün, Anregung = 504 nm, emittierend = 523 nm; rot, Anregung = 551 nm, emittierend = 567 nm).
- Fügen Sie die Abbildungen zusammen, um die Tumorzellen zu zeigen, die von den NETs gefangen sind.
Anmerkung: In einigen Experimenten wurde das DNA-Abbauenzym 5 min vor der Co-Inkubation für 5 min in die LDN-Kultur gegeben (Endkonzentration von 100 U/ml).