Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von neutrophilen extrazellulären Fallen oder NETs: Eine Technik zur Analyse der Postadhäsionsinteraktion zwischen Krebszellen und NETs

Zusammenfassung

Quelle: Kanamaru, R. et al. Neutrophile extrazelluläre Fallen, die von Neutrophilen niedriger Dichte erzeugt werden, die aus der Peritonealspülung gewonnen werden, vermitteln das Wachstum und die Bindung von Tumorzellen. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video analysieren wir das Postadhäsionsverhalten von Krebszellen, die in neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) gefangen sind, indem wir Neutrophile mit niedriger Dichte und Magenkrebszellen co-kultivieren. Die Zeitraffer-Videoanalyse hilft bei der Überwachung verschiedener zellulärer Ereignisse und der Untersuchung der Rolle von NETs bei pathologischen Zuständen.

Protokoll

>1. Zeitraffer-Videoanalyse der eingeschlossenen Tumorzellen

1. Die peritonealen LDNs werden in einer runden 35-mm-Schale, die mit Poly-L-Lysin beschichtet ist, kultiviert und 2 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert.
2. Fügen Sie den grün fluoreszierenden Farbstoff zur Färbung des Zellkerns und der Chromosomen hinzu, um NETs bei der Endkonzentration von 5 μM sichtbar zu machen.
3. Entfernen Sie nach 1 Minute Inkubation das Medium und fügen Sie 2 ml 0,1 % BSA + RPMI 1640 hinzu.
4. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie ungefärbte 1 x 10⁶ MKN45-Zellen hinzu, die in 0,1 % BSA + RPMI 1640 suspendiert sind. 5 min bei RT inkubieren.
5. Entfernen Sie alle nicht anhaftenden Tumorzellen, indem Sie das Geschirr vorsichtig spülen, indem Sie 2 ml vorgewärmtes Medium (0,1 % BSA + RPMI 1640) hinzufügen und das Gericht schwenken.
6. Wiederholen Sie den obigen Waschvorgang zweimal.
   Anmerkung: Da NETs schwach an der Platte haften, sollte das Waschen so schonend wie möglich erfolgen, um ein Entfernen der NETs selbst zu vermeiden.
7. Fügen Sie DMEM mit 10 % FCS hinzu, ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin.
8. Montieren Sie die Kulturschale in einem Ganzansichts-Zellbeobachtungssystem und wählen Sie das entsprechende Feld aus, in dem Tumorzellen von den NETs gefangen werden.
9. Fahren Sie mit der Co-Kultur für weitere zwei Tage fort und machen Sie alle 6 Minuten unter normalem Licht und Fluoreszenz kontinuierliche Fotos des Feldes, wodurch MKN45-Zellen bzw. NETs nachgewiesen werden.
10. Überlagern Sie die Bilder zu jedem Zeitpunkt und erstellen Sie Zeitraffervideos mit der Image Viewer-Software.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SYTOX grüne Nukleinsäure-Färbung 5mM Lösung in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Nr. S7020
RPMI1640 Mittel	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. R8758
Dulbecco's Modified Eagle Mittelhohe Glukose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. D5796
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. D8537
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen	gibco by life technologies, Mexiko	Tel.: 10437-028
Rinderserumalbumin lyophilisiertes Pulver, ≥96% (Agarose-Gelelektrophorese)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	Nr. 15140-122
Plasmocin Prophylaxe	InvivoGen, San Diego, Kalifornien, USA	ANANT-MPP
Fluoreszein-Stereomikroskop	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Ganzansichts-Zellenbeobachtungssystem	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 humane Magenkrebs-Zelllinie	Riken, Tukuba Japan	N/A