Präparation von Exosomenblöcken: Ein Protokoll zur Konservierung von Exosomen aus kultivierten menschlichen Darmkrebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Jung, M. K. et al. Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen mittels Transmissionselektronenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Herstellung von Exosomenblöcken aus kultivierten gastrointestinalen Tumorzellen. Diese Exosomenblöcke können weiter geschnitten, gefärbt und abgebildet werden, um die Position bestimmter Proteine im Lipiddoppelschicht-Vesikel zu bestimmen.

Protokoll

>1. Blockpräparation von Exosomen

1. Die Exosomen aus dem Kulturüberstand von HCT116-Zellen werden durch Zentrifugation bei 100.000 x g für 1,5 h pelletiert. Entfernen Sie den Kulturüberstand und fixieren Sie das gereinigte Exosomenpellet vorsichtig mit 1 ml 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatlösung (pH 7,0) für 1 h bei 4 °C. Für 0,1 M Natriumcacodylat 4,28 g Cacodylsäure in 160 ml destilliertem Wasser (DW) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M HCl auf 7,4 ein und füllen Sie ihn dann mit destilliertem Wasser auf 200 mL auf.
2. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie die Pellets mit 1 ml 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei Raumtemperatur aus. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, wobei jeder Wechsel 10 Minuten dauert.
3. Die Probe wird 1 h lang bei 4 °C mit 1 ml 2 % Osmiumtetroxid fixiert.
4. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie es alle 10 Minuten dreimal mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer aus.
5. 10 Minuten lang mit einer abgestuften Acetonreihe (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %) auf dem Schüttler inkubieren.
6. Entfernen Sie das Aceton und inkubieren Sie die Lösung aus 3:1 Aceton:niedrigviskosem Einbettungsgemisch für 30 Minuten. Das Exosom-Pellet befindet sich in der Röhre.
7. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1:1 Aceton:niedrigviskoses Einbettungsmischmedium hinzu, dann 30 Minuten inkubieren.
8. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1:3 Aceton:niedrigviskoses Einbettungsmischmedium hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang.
9. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie eine 100% niedrigviskose Einbettmischung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
10. Die Probe wird mit der Einbettungsform in eine reine Einbettmischung mit niedriger Viskosität eingebettet und 24 Stunden lang bei 65 °C gebacken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glutaraldehyd	ems	Nr. 16200
Natriumcacodylat	ems	12300
Osmiumtetroxid 1 g Kristall	ems	19100	Nur im Abzug verwenden
Aceton	JUNSEI	Nr. 1B2031

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