Gold-Immunfärbung von exosomalen Schnitten: Eine Technik zur Visualisierung diagnostischer Marker im exosomalen Lumen

Abstract

Quelle: Jung, M. K., Mun, J. Y. Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen durch Transmissionselektronenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir die Goldimmunfärbung von Biomarkern, die im Lumenbereich von ultradünnen exosomalen Schnitten lokalisiert sind. Diese Technik ermöglicht die frühzeitige Diagnose von Krankheiten durch Visualisierung von Zielmolekülen innerhalb der Exosomen, die von den erkrankten Zellen sezerniert werden.

Protocol

>1. Immunfärbung von Exosomenschnitten und Bildgebung

1. Bereiten Sie 60 nm ultradünne Schnitte eines Exosomenblocks mit einem Ultramikrotom vor und sammeln Sie sie auf einem Nickelgitter
.
2. Inkubieren Sie die Gitter in 50 μl Tropfen 0,02 M Glycin für 10 Minuten, um die freien Aldehydgruppen zu löschen.
3. Dreimal 10 Minuten lang 10 μl DW einspülen. 1 h lang bei Raumtemperatur in PBS mit 1 % BSA inkubieren.
4. Inkubieren Sie die Gitter 1 h lang in 50-100 μl Tropfen Anti-KRS-Antikörper (1:100 in PBS mit 0,1 % BSA) (Falls erforderlich, sollte dieser Schritt bei 4 °C über Nacht durchgeführt werden.)
5. Waschen Sie die Gitter mit fünf separaten Tropfen (50 μl) PBS mit 0,1 % BSA für jeweils 10 Minuten.
6. Die Gitter werden für 1 h in Tropfen des Sekundärantikörpers überführt (Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit 10 nm Goldpartikeln (1:100) in PBS mit 0,1 % BSA).
7. Waschen Sie die Gitter alle 10 Minuten mit fünf separaten Tropfen (50 μl) PBS mit 0,1 % BSA.
8. Doppelfärbung mit 2% Uranylacetat für 20 min unter dunklen Bedingungen bzw. mit Reynolds Bleicitrat für 10 min.
9. Betrachten Sie die Gitter unter Transmissionselektronenmikroskopie bei 80 kV.
10. Klicken Sie auf "Erfassen" und dann auf "Datei" und dann auf "Speichern unter" im CCD-Kamerasystem unter dem TEM bei 80 kV. Die Belichtungszeit folgte den automatischen Einstellungen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uranylacetat	ems	Artikel-Nr.: 22400	Gefährliche Chemikalie
Bleicitrat	ems	Nr.: 17900
Transmissionselektronenmikroskopie	Hitachi	Nr. H7600
Kupfer-Gitter	ems	G200-Cu
Glycin	Sigma	Artikel-Nr.: 022K5404
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Sigma	Nr. P4417
Rinderserumalbumin	Aurion	Artikel-Nr.: 25557
Gereinigter Anti-Human-Antikörper CD274 (B7-H1, PD-L1)	BioLegende	Artikel-Nr.: 329710	Ganzer Berg Immumogold
Aufgereinigte Maus IgG2b, κ Isotyp Strg	BioLegende	401202	Ganzes Berg-Immumogold (Kontrolle)
2. Anti-Maus-IgG-konjugiertes 9-11 nm Goldpartikel	Sigma	Nr. G7652
Paraformaldehyd	ems	Nr. 19210