Gold-Immunfärbung von exosomalen Schnitten: Eine Technik zur Visualisierung diagnostischer Marker im exosomalen Lumen

>1. Immunfärbung von Exosomenschnitten und Bildgebung

1. Bereiten Sie 60 nm ultradünne Schnitte eines Exosomenblocks mit einem Ultramikrotom vor und sammeln Sie sie auf einem Nickelgitter
.
2. Inkubieren Sie die Gitter in 50 μl Tropfen 0,02 M Glycin für 10 Minuten, um die freien Aldehydgruppen zu löschen.
3. Dreimal 10 Minuten lang 10 μl DW einspülen. 1 h lang bei Raumtemperatur in PBS mit 1 % BSA inkubieren.
4. Inkubieren Sie die Gitter 1 h lang in 50-100 μl Tropfen Anti-KRS-Antikörper (1:100 in PBS mit 0,1 % BSA) (Falls erforderlich, sollte dieser Schritt bei 4 °C über Nacht durchgeführt werden.)
5. Waschen Sie die Gitter mit fünf separaten Tropfen (50 μl) PBS mit 0,1 % BSA für jeweils 10 Minuten.
6. Die Gitter werden für 1 h in Tropfen des Sekundärantikörpers überführt (Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit 10 nm Goldpartikeln (1:100) in PBS mit 0,1 % BSA).
7. Waschen Sie die Gitter alle 10 Minuten mit fünf separaten Tropfen (50 μl) PBS mit 0,1 % BSA.
8. Doppelfärbung mit 2% Uranylacetat für 20 min unter dunklen Bedingungen bzw. mit Reynolds Bleicitrat für 10 min.
9. Betrachten Sie die Gitter unter Transmissionselektronenmikroskopie bei 80 kV.
10. Klicken Sie auf "Erfassen" und dann auf "Datei" und dann auf "Speichern unter" im CCD-Kamerasystem unter dem TEM bei 80 kV. Die Belichtungszeit folgte den automatischen Einstellungen.