Negative Färbung von gereinigten Exosomen: Ein Verfahren zur Visualisierung der Exosomenmorphologie mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Jung, M. K. et al. Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen durch Transmissionselektronenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur negativen Färbung von gereinigten Exosomen. Die negativ gefärbten Exosomen werden mittels Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet. Diese Technik hilft, die Morphologie von Exosomen sichtbar zu machen.

Protokoll

>1. Negative Färbung

1. Glimmentladung der dünnen, mit Formvar/Carbon-Film beschichteten 200-Mesh-Kupfer-EM-Gitter für 1 min durch Glimmentlader.
2. Fixieren Sie gereinigte Exosomen mit 1 mL 2 % Paraformaldehyd (PFA) für 5 min.
   HINWEIS: Paraformaldehyd-Dämpfe sind giftig. Alle Arbeiten sollten in einem belüfteten Abzug erledigt werden.
3. Laden Sie 5-7 μl Exosom-Suspensionslösung auf das Gitter und inkubieren Sie für 1 min. Wenn die Konzentration des Exosoms zu hoch ist, verdünnen Sie die Konzentration auf die Hälfte bis ein Fünftel.
4. Färben Sie sofort mit den ~20 Tropfen gefilterter 1%iger Uranylacetat (UA)-Lösung mit einer Spritze auf die Oberfläche des EM-Gitters.
5. Entfernen Sie die überschüssige UA-Lösung auf dem Gitter, indem Sie den Gitterrand mit Filterpapier berühren.
6. Spülen Sie den Rost schnell mit einem Tropfen Wasser ab. Dieser Schritt entfernt die überschüssige Färbelösung.
7. Legen Sie den Rost mit einer Pinzette auf den Tisch und decken Sie den Rost teilweise mit einer Kulturschale ab, um ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen zu lassen.
8. Speichern Sie das Netz in einer EM-Gitterbox für die zukünftige Beobachtung durch ein TEM bei 80 kV.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Uranylacetat	ems	Artikel-Nr.: 22400	Gefährliche Chemikalie
Transmissionselektronenmikroskopie	JEOL	JEM2200FS
Glimm-Entlader	JEOL	JFC1100E
Paraformaldehyd	ems	Nr. 19210
Formvar kohlenstoffbeschichtetes Kupfer Gitter (200 mesh)	ems	FCF200-CU
Formvar kohlenstoffbeschichtetes Nickel Gitter (200 mesh)	ems	FCF200-NI