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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Einfrieren und Aufsteigen von Muskeln
- Tauchen Sie die untere Hälfte eines kleinen Plastikbechers (50 ml), der Isopentan enthält, in flüssigen Stickstoff. Das Isopentan ist gebrauchsfertig, wenn es leicht viskos wird und bildet ein festes weißes Laminat, das die Innenseite des Becherglases auskleidet (Temperatur: -160 °C).
Anmerkung: Verwenden Sie immer funkenfreie Handwerkzeuge aus Bronze oder Aluminium. Vermeiden Sie das Einatmen von Produktdampf. Bei ausreichender Belüftung verwenden. Wenn der Umgang mit einer Verschüttung unmöglich oder unpraktisch ist, tragen Sie eine geeignete Atemschutzmaske.
- Frieren Sie etwas Einbettmedium auf einem Futter (Korken) ein, indem Sie es kurz (10 s) in Isopentan tauchen.
- Fassen Sie den Muskel (z. B. den Tibialis oder Gastrocnemius) an, indem Sie ihn an der Sehne senkrecht relativ zum Korken halten, um die Ausrichtung der Fasern beizubehalten und Querschnitte zu ermöglichen.
- Positionieren Sie den letzten Teil des frischen Muskels vorsichtig auf dem gefrorenen Einbettmedium.
Anmerkung: Der Muskel wird kleben. Es ist wichtig, den Muskel NICHT vollständig mit Einbettmedium zu umgeben. Wichtig ist auch, die vertikale Ausrichtung für die spätere Bestimmung der Querschnittsfläche beizubehalten.
- Tauchen Sie das Futter mit dem anhaftenden Muskel in das Isopentanbad (die übliche Gefrierzeit beträgt 7-15 s, abhängig von der Probengröße und -zusammensetzung)
Anmerkung: Das Eintauchen in die Gefrierlösung sollte nicht länger dauern, als zum vollständigen Einfrieren der Probe erforderlich ist. Ein zu langes Einfrieren löst den Gewebeblock auf, während eine zu kurze Zeit zur Bildung von Eiskristallen führt. Ein gut gefrorenes Exemplar ist kalkweiß.
- Nach dem Einfrieren der Probe legen Sie sie in eine kleine Plastiktüte oder ein Probenröhrchen (50 mL) und lagern Sie sie sofort in einem Tiefkühlschrank bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff.
2. Muskelsektion
- Stellen Sie die Arbeitstemperatur der Kryostat-Innenkammer auf ca. -23 °C ein.
- Lassen Sie die Probe (die zuvor bei -80 °C gelagert wurde) bei der Arbeitstemperatur akklimatisieren (ein paar Stunden sollten ausreichen).
- Schneiden Sie mehrere 8 μm dicke Abschnitte der Probe (vorzugsweise den Musculus tibialis anterior oder den Musculus gastrocnemius) und sammeln Sie sie auf Objektträgern.
Anmerkung: Schneide den Abschnitt im mittleren Bauchbereich des Muskels ab. Schneide die Abschnitte der Genauigkeit halber senkrecht zur Montageachse.
- Bewahren Sie die Objektträger in der Kryostatkammer auf. Lassen Sie sie nicht auftauen, wenn es darum geht, IF/IHC-Studien oder enzymatische Färbungen durchzuführen.
- Lagern Sie die Objektträger bei -80 °C für weitere Analysen.