Whole Mount Präparation des Mausdarms: Verwendung eines einfachen Darmschneidegeräts zur Präparation des Whole Mount

Zusammenfassung

Quelle: Yoneda, M. et al. Ein einfaches Gerät zur schnellen Vorbereitung ganzer Halterungen des Mäusedarms. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir die gesamte Vorbereitung des Mausdarms mit einem einfachen Darmschnittgerät. Die resultierenden Halterungen sind von höchster und einheitlicher Qualität und können für histologische Analysen verwendet werden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Gerät

1. Den Hauptteil der Basis der Vorrichtung wird aus einem massiven Block von hochdichtem Acetylharz bearbeitet, wie in diesem Manuskript beschrieben. Erstellen Sie an jedem Ende 3 mm hohe Streifen und fräsen Sie aus diesen 2,5 mm Rillen die Stangen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2).
2. Stellen Sie Stäbe aus einem Edelstahl mit einem Durchmesser von 2,4 mm mit abgerundeten Enden her.
Anmerkung:Der Hauptrahmen des Deckels wurde aus Duraluminiumblech gefräst.

>2. Nutzung des Geräts

1. Präparieren Sie den Dünndarm und den Dickdarm mit einer Schere und behandschuhten Fingern aus der Bauchhöhle. Entfernen Sie das Mesenterium, indem Sie es mit einer gebogenen Pinzette festhalten und vorsichtig vom Darm wegziehen.
2. Spülen Sie den Darm mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) mit einer Gilson-Pipettenspitze, die an ihrem breiteren Ende abgeschnitten wurde, damit sie auf eine 10- oder 20-ml-Kunststoffspritze passt.
3. Lege den Dünndarm (SB) auf ein Blatt Papiertuch und teile ihn mit einer Schere in drei gleich lange Abschnitte (proximal, mittel und distal – SB1, SB2 und SB3). Entferne den Blinddarm und lege den Dickdarm aus.
4. Machen Sie mit einer Schere mehrere sehr kleine Schnitte in die Darmsegmente, damit die Flüssigkeit entweichen kann, legen Sie ein Blatt Papiertuch über den Darm und fahren Sie vorsichtig mit einem Finger über die Präparate, um die Flüssigkeit herauszudrücken und trocken zu tupfen.
5. Heben Sie die Profile an und setzen Sie die Edelstahlstäbe ein, die zuvor durch Einweichen in einem Becherglas mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung benetzt wurden.
   Anmerkung: Der Darm kann auf Wunsch umgedreht werden (auf links gedreht).
6. Beschriften Sie ein Stück Karton oder Filterpapier, das so zugeschnitten ist, dass es in die Basis des Geräts passt. Bleistift ist am besten geeignet, da er von praktisch allen Lösungen nicht beeinflusst wird. Es werden das Autopsiedatum, der Versuchscode und die Tieridentifikationsnummer vorgeschlagen.
7. Legen Sie die Karte oder das Filterpapier in den Boden des Geräts ein. Führen Sie die Stäbchen und Därme in die Schlitze an der Basis des Geräts ein. Stellen Sie sicher, dass das proximale Ende der Segmente standardisiert positioniert ist. Die proximalen Enden sollten sich in der Nähe der Kartenetiketten befinden.
8. Platzieren Sie das obere Teil des Geräts über der Basis. Führen Sie mit den abgewinkelten Stäben eine Skalpellklinge, um die Abschnitte in Längsrichtung zu schneiden.
   Anmerkung: Es hilft, wenn das Taschentuch vorsichtig und vorsichtig mit dem Finger gehalten wird, um sicherzustellen, dass es sich nicht mit dem Messer bewegt.
9. Entfernen Sie das obere Teil des Geräts. Entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier und die Taschentücher (die sich noch an den Stäben befinden).
   Anmerkung: Ein Stück steife Pappe, das unter das Filterpapier gelegt wird, hilft beim Anheben.
10. Leicht nass (mit einer behandschuhten Fingerspitze, die in PBS getaucht ist) die Segmente. Rollen Sie den Stab von einer Seite zur anderen, um den Darm zu öffnen und flach auszubreiten. Das Tuch haftet dann an dem Filterpapier.
11. Untersuchen Sie die Präparate visuell auf grobe Läsionen.
12. Das auf dem Filterpapier haftende Tuch wird in ein flaches Bad (oder eine Sandwichdose) gegeben, das ein Fixiermittel enthält
    Anmerkung: Nachdem das Taschentuch auf dem Filterpapier oder auf der Karte haftet, bleibt es fest haften. Eine breite Palette von Fixiermitteln kann verwendet werden, um die Zubereitung zu konservieren. Es wird empfohlen, dass die Carnoy-Flüssigkeit zur Untersuchung der Proliferation von Darmzellen verwendet wird, was die ideale Fixierung für die besten Zellproliferationsmethoden ist. Es können aber auch Formalin oder viele andere Fixiermittel verwendet werden, wenn andere Endpunkte benötigt werden.
13. Nach der Fixierung (in der Regel 3 h) die Präparate in 70%iges Ethanol umfüllen. Die Proben können dann bis zum Bedarf gelagert werden. Die Präparate können en face untersucht und/oder zur Vorbereitung histologischer Proben für H&E oder andere histologische Färbetechniken, Immunhistochemie und/oder In-situ-Hybridisierung verwendet werden.
    Anmerkung: Eine verlängerte Fixierung kann die immunhistochemische Reaktivität und/oder die in situ Hybridisierungsreaktivität reduzieren. Sandwichboxen aus Polypropylen sind ideal für die Aufbewahrung einer großen Anzahl von Zubereitungen.
14. Bei Bedarf können die fixierten Gewebe aus den verschiedenen Darmabschnitten zu "Schweizer Rollen" verarbeitet und mit der gesamten Palette histologischer Methoden, einschließlich der oben beschriebenen, gefärbt werden. Für eine "Schweizer Rolle" werden die Darmsegmente aus dem Filterpapier genommen, um ein Cocktailseriesel oder einen Zahnstocher gerollt, mit einer entomologischen Nadel gesichert und für die Wachseinbettung aufbereitet.
15. Färben Sie das Volumengewebe bei Bedarf mit Methylenblau, um aberrante Kryptenherde sichtbar zu machen.
16. Ritzen Sie die festgelegten Vorbereitungen in aller Ruhe.

Ergebnisse

Abbildung 1. Fotos des Originalgeräts.Das ursprüngliche Gerät wurde aus mehreren Metallstücken gebaut, die von Hand vorbereitet wurden. (A) Das Gerät zusammengebaut. (B) Die Oberseite des Geräts wurde entfernt, um die Stangen in Position zu bringen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Delrin	Ryan Plastics, Earls Barton, Großbritannien		Ein ähnliches Material aus Acetalharz mit hoher Dichte würde ausreichen
Duraluminium-Platte	Metal Supplies Ltd, Park Road, Dukinfield. SK16 5LP Großbritannien		Aluminiumgehäuse aus dem Jahr 1909, so dass alternative Lieferanten verfügbar sind
Fertige(s) Gerät(e) einsatzbereit	Kontaktieren Sie Dr. Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk		Kontaktieren Sie r.goodlad@imperial.ac.uk für Lieferdetails