$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Lösungen
- Wie in Tabelle 1 beschrieben, bereiten Sie den Dickdarmpuffer, das Dichtetrennmedium auf Siliziumdioxidbasis 100 %, das Dichtetrennmedium auf Siliziumdioxidbasis 66 %, das Dichtetrennmedium auf Siliziumdioxidbasis 44 %, den Kollagenase-E-Aufschlusspuffer und den FACS-Puffer vor.
- Bereiten Sie Colon Buffer am Tag vor dem Eingriff vor und lagern Sie es über Nacht bei 4 °C.
- Bereiten Sie am Tag vor dem Eingriff ein Dichtetrennmedium auf 100 % Siliziumdioxidbasis vor und lagern Sie es über Nacht bei 4 °C, bevor Sie es am Morgen des Eingriffs zum Auftauen bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Bereiten Sie am Morgen der Isolierung Trennmedien auf 66 % und 44 % Siliziumdioxidbasis mit 100 % Dichtetrennmedien auf Kieselsäurebasis bei Raumtemperatur und Dickdarmpuffer vor.
- Messen Sie die entsprechende Menge an Clostridium histolyticum-abgeleiteter Kollagenase E und lagern Sie sie über Nacht vor dem Eingriff bei -20 °C. Am nächsten Morgen lösen Sie sich in der entsprechenden Menge Dickdarmpuffer auf, um Kollagenase-Verdauungspuffer zu erhalten. Bei allen Inkubationen mit Kollagenase-Aufschlusspuffer am Tag des Eingriffs die Lösungen auf 37 °C vorwärmen.
- Während des gesamten Protokollschritts ist eine Zentrifuge bei 20 °C und einer Drehzahl von 859 x g zu halten, wobei die Bremsen für die Gradientenzentrifugation deaktiviert (0 Verzögerung) sind. Stellen Sie eine weitere auf 4 °C und eine Drehzahl von 859 x g mit der Standardverzögerung für die Waschschritte ein.
>2. Ernte des Dickdarms
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung, gefolgt von einer von der AALAC zugelassenen Bestätigungsmethode.
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage und besprühen Sie das Fell mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer großen Gewebeschere einen vertikalen Schnitt in der Mittellinie und legen Sie das intakte Bauchfell frei.
- Öffnen Sie mit einer feinen Präparierschere das Bauchfell. Schieben Sie den Dünndarm mit einer Pinzette zur Seite und legen Sie den absteigenden Dickdarm frei. Ziehen Sie den absteigenden Dickdarm leicht nach oben, um den rektalen Teil des Dickdarms maximal freizulegen. Schneiden Sie das distale Rektum tief in das Becken und präparieren und entfernen Sie den gesamten Dickdarm als eine Einheit, vom distalen Rektum bis zur Blinddarmkappe.
- Übertragen Sie den Dickdarm in 20 mL gekühlten Colon Buffer in ein 50 mL Polypropylen-Röhrchen.
>3. Den Dickdarm reinigen
- Legen Sie den Dickdarm auf ein angefeuchtetes Papiertuch und ziehen Sie den festen Stuhl heraus, indem Sie mit dem stumpfen Ende einer Schere oder Pinzette leichten Druck auf die Darmwand ausüben.
- Legen Sie den Dickdarm in eine Petrischale und spülen Sie den Darm mit 10 ml gekühltem Dickdarmpuffer unter Verwendung einer 10-ml-Spritze mit einer 18-G-Nadel mit stumpfer Füllung.
- Übertragen Sie den Dickdarm auf ein mit Colon Buffer angefeuchtetes Papiertuch und entfernen Sie das Mesenterium und das Fett mit dem scharfen Ende einer Schere.
- Legen Sie den Dickdarm in eine Petrischale, die mit 5-10 ml gekühltem Dickdarmpuffer gefüllt ist, und rühren Sie manuell, um den restlichen Dickdarminhalt zu waschen. 2-3 Mal wiederholen.
- Schneiden Sie den Dickdarm in Längsrichtung von seinem muskulöseren rektalen Ende bis zum proximalen Dickdarm (wodurch ein einzelnes rechteckiges offenes Dickdarmstück entsteht) in einer Petrischale, die mit frischem, gekühltem Dickdarmpuffer gefüllt ist. Entsorgen Sie vorhandene Medien und füllen Sie sie mit sauberem, gekühltem Dickdarmpuffer nach.
- Waschen Sie den Darm 3 Mal, indem Sie ihn kräftig in der Petrischale schwenken und nach jedem Waschen die 5-10 ml gekühlten Dickdarmpuffer ersetzen.
- Legen Sie das rechteckige Dickdarmtuch auf ein mit Colon Buffer angefeuchtetes Papiertuch und schneiden Sie es in horizontales und dann in kleine Fragmente (3 mm x 3 mm große Abschnitte).
- Sammeln Sie die Dickdarmfragmente vorsichtig mit einer feinen Zange in 20 mL gekühlten Dickdarmpuffer in einem konischen 50-ml-Polypropylenröhrchen.
- Waschen Sie die Dickdarmfragmente dreimal, jeweils in 20 ml Dickdarmpuffer, indem Sie den Schlauch 30 s lang kräftig schwenken. Lassen Sie die Gewebefragmente zwischen jedem Rühren am Boden des Röhrchens absetzen. Dekantieren oder vakuumieren Sie den Überstand und verhindern Sie gleichzeitig den Verlust von Gewebefragmenten während des Aspirationsprozesses zwischen den einzelnen Wäschen.
Anmerkung: Es ist nicht erforderlich, die Tube nach jeder Wäsche zu wechseln.
>4. Kollagenase-Verdauung 1
- Geben Sie 20 ml des Kollagenase-Aufschlusspuffers zu den gewaschenen Dickdarmfragmenten im konischen 50-ml-Polypropylen-Röhrchen.
- Legen Sie das geschlossene 50-ml-Röhrchen bei 37 °C in einen inkubierten Orbitalschüttler mit einer Rotationsrate von 2 x g für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während des Rührens in ständiger Bewegung sind. Erhöhen Sie bei Bedarf die Rotationsrate schrittweise, um sicherzustellen, dass sich keine Gewebefragmente am Röhrchenboden absetzen.
>5. Trennmediengradienten auf Siliziumdioxidbasis vorbereiten
- Bereiten Sie Dichtetrennmedien auf 66 % und 44 % Siliziumdioxidbasis unter Verwendung von Dichtetrennmedien auf 100 % Siliziumdioxidbasis bei 20 °C (Raumtemperatur) und Dickdarmpuffer vor.
- Gießen Sie 5 ml Dichtetrennmedium auf 66 % Siliziumdioxidbasis in jeweils 3 separate 15-ml-Polypropylenröhrchen. Bereiten Sie drei Röhrchen pro Doppelpunkt vor. Dies bildet die Basis für das Gradientenisolationsverfahren mit höherer Dichte, auf das Trennmedien mit niedrigerer Dichte geschichtet werden, um den Trenngradienten zu erzeugen.
- Bis zur Verwendung bei 20 °C lagern.
>6. Sammlung von Überständen aus dem Aufschluss 1
- Sammeln Sie nur den Überstand mit einer serologischen 25-ml-Pipette und filtrieren Sie den Überstand durch ein 40-μm-Poren-Filtrationsgewebe-Zellsieb, das in ein sauberes konisches 50-ml-Polypropylenröhrchen gegeben wird, nachdem der Kollagenase-Aufschluss 1 abgeschlossen ist. Achten Sie darauf, keine vorhandenen Gewebefragmente zu aspirieren.
HINWEIS: Bewahren Sie alle verbleibenden sichtbaren Gewebefragmente im Röhrchen auf. Diese werden einem zweiten Kollagenase-Verdau unterzogen (Schritt 8).
>7. Quenching Kollagenase Digest Puffer
- Füllen Sie das 50-ml-Polypropylen-Röhrchen vollständig mit gekühltem Dickdarmpuffer.
Anmerkung: Kollagenase ist bei 37 °C aktiv; Daher inaktiviert gekühlter Puffer dieses Enzym .
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 4 °C bei 800 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Vakuumaspiration. Waschen Sie die Zellen mit 25 mL frischem Dickdarmpuffer und zentrifugieren Sie sie bei 800 x g für 5 min.
- Resuspendieren Sie das Pellet in weniger als 1 ml frischem, gekühltem Dickdarmpuffer.
- Legen Sie das konische 50-ml-Röhrchen aus Polypropylen auf Eis.
>8. Kollagenase-Verdauung 2
- Wiederholen Sie Schritt 4 (Verdauung 1) mit den verbleibenden Gewebefragmenten aus Schritt 6.1.
>9. Gewebedisaggregation nach der Verdauung 2
- Spülen Sie die Gewebefragmente kräftig zwischen dem Röhrchen und einer 10-ml-Spritze durch eine 18-G-Nadel mit stumpfem Ende hin und her.
- Wiederholen Sie diese Spülung für mindestens 7-8 vollständige Passagen und fahren Sie fort, bis keine groben Gewebefragmente oder Ablagerungen mehr sichtbar sind.
10. Zellen filtern
- Geben Sie die Gewebedisaggregationssuspension durch ein 40 μm Poren-Filtrationsgewebe-Zellsieb in ein sauberes 50-ml-Polypropylenröhrchen.
- Waschen Sie das Zellensieb des Filtergewebes mit 10 ml gekühltem Dickdarmpuffer, um alle im Filter verfangenen Zellen zu bergen.
11. Kollagenase-Verdauung abschrecken
- Füllen Sie das konische 50-ml-Röhrchen aus Polypropylen bis zum Rand mit gekühltem Dickdarmpuffer.
HINWEIS: Die Temperatur von Colon Buffer ist entscheidend, um die Quenching der Kollagenaseaktivität zu gewährleisten.
- Schleudern bei 4 °C und 800 x g für 5 min.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Vakuumaspiration.
- Waschen durch Resuspendieren in 25 mL frischem, gekühltem Dickdarmpuffer und anschließender Zentrifugation bei 4 °C, 800 x g für 5 Minuten.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Vakuumaspiration.
- Bündeln Sie das resuspendierte Pellet aus dem Kollagenase-Aufschluss 1 (Schritt 7) in das entsprechende Röhrchen aus Schritt 11.4.
- Schritt 11.4 (Waschen und Zentrifugieren) wiederholen.
>12. Dichtetrennmittel-Gradiententrennung auf Siliziumdioxidbasis
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 12-13 so schnell wie möglich aus, um eine schnelle Löschung der Kollagenaseaktivität zu gewährleisten.
- Nach Schritt 11.7 resuspendieren Sie jedes Pellet in 24 ml insgesamt 44 % Dichtetrennmedium auf Siliziumdioxidbasis pro Dickdarm.
- Mit einer serologischen 10-ml-Pipette werden langsam 8 ml des Mediums aus Schritt 12.1 auf jedes der drei in Schritt 5.2 vorbereiteten Röhrchen (mit 66 % Dichtetrennmedien auf Siliziumdioxidbasis) aufgetragen. Halten Sie einen gleichmäßigen und langsamen Fluss des Trennmediums mit 44 % Dichte aufrecht, während Sie den Gradienten schichten, um eine Störung der Grenzfläche zu vermeiden.
- Balancieren Sie alle Röhrchen in den Zentrifugeneimern vorsichtig mit einer Waage oder einer Waage aus.
- Die Röhrchen werden 20 min bei 859 x g in einer Zentrifuge ohne Bremse bei 20 °C geschleudert. Lassen Sie die Rotoren vollständig zur Ruhe kommen, bevor Sie die Röhrchen entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen an der Gradientengrenzfläche nicht beschädigt werden.
13. Mononukleäre Zellen von der Gradientenschnittstelle sammeln
- Visualisieren Sie die Gradientenschnittstelle (in der Nähe der 5-ml-Markierung), an der typischerweise eine 1-2 mm dicke weiße Bande (mit MNC) vorhanden ist.
Anmerkung: Man kann ein weißes Band sehen oder auch nicht. MNC wird sich jedoch an dieser Schnittstelle befinden und sollte die Klarheit der Gradientenschnittstelle trüben.
- Vakuumieren Sie die oberen 7 ml des oberen Gradienten und verwerfen Sie sie, um einen leichteren Zugang der Pipette zur Schnittstelle zu ermöglichen.
- Sammeln Sie die Grenzschicht der Zellen durch kontinuierliches manuelles Saugen und gleichmäßige Drehbewegungen des Handgelenks in einem sauberen konischen 50-ml-Polypropylenröhrchen. Sammeln, bis die Grenzfläche zwischen den beiden Gradienten klar und refraktil (frei von Zellen) ist.
- Füllen Sie das Sammelröhrchen mit 50 mL gekühltem FACS-Puffer. Bei 4 °C, 800 x g 5 Min. schleudern.
- Der Überstand wird durch Vakuumaspiration abgesaugt und das Pellet in 1 ml FACS-Puffer resuspendiert.
- Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer in einer Verdünnung von 1:2 unter Verwendung geeigneter Methoden zum Ausschluss toter Zellen.
- Fahren Sie mit der FACS-Färbung oder anderen Assays mit frisch isoliertem Dickdarm-MNC fort.
Tabelle 1: Tabelle zur Lösungsvorbereitung
| Lösung | Formel |
| Doppelpunkt-Puffer | 500 mL RPMI + 10 mM HEPES + 10 % FBS (60 Minuten lang bei 56°C hitzeinaktiviert, pH-Wert auf 7,3 eingestellt) |
| Dichtegradientenmedien auf Siliziumdioxidbasis 100 % (pro Doppelpunkt) | 22,5 mL Dichtegradientenmedium auf Siliziumdioxidbasis + 2,5 mL 10x PBS. |
| Dichtegradientenmedien auf Siliziumdioxidbasis 66 % (pro Doppelpunkt) | 10,72 mL Dichtegradientenmedium auf Siliziumdioxidbasis 100 % + 5,28 mL Dickdarmpuffer |
| Dichtegradientenmedien auf Siliziumdioxidbasis 44 % (pro Doppelpunkt) | 11 mL Dichtegradientenmedium auf Siliziumdioxidbasis 100 % + 14 mL Dickdarmpuffer |
| Kollagenase-Verdauungspuffer (pro Dickdarm) | 100 U/mL Collagenase E aus Clostridium histolyticum, gelöst in 40 mL Colon Buffer |
| FACS-Puffer | 500 mL 1x PBS + 5 g BSA + 1 mm EDTA + 0,2 g Natriumazid |