Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Etablierung von vom Menschen stammenden 3D-Organoiden des Magenfundus
HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, führen Sie das Protokoll in seiner Gesamtheit in einer sterilen Gewebekulturhaube durch. Es wurde humanes Fundgewebe von Patienten entnommen, die sich einer Schlauchmagenoperation unterzogen.
- Entnehmen Sie das Gewebe von Patienten, die sich einer Schlauchmagenoperation unterziehen, und legen Sie es in die eiskalte Ca2+/Mg2+-freie Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in einem großen Kunststoffbehälter.
- Waschen Sie das Gewebe mit einer Pinzette kräftig in einem sterilen Becherglas mit 100 mL Ca2+/Mg2+-freiem DPBS. Waschen Sie ca. 30 s lang oder bis die Ablagerungen und das Blut entfernt wurden. Wischen Sie anschließend mit steriler Gaze die Schleimschicht vom Epithel ab.
- Fassen Sie mit einer großen Pinzette die Muskelschicht des Gewebes fest und kratzen Sie das Epithel mit der großen gebogenen hämostatischen Pinzette mit Gewalt ab. Sammeln Sie die abgeschabten Epithelfragmente in einer sterilen Petrischale aus Styropor.
- Zerkleinern Sie das Epithelgewebe mit Hilfe von Rasierern in ca. 2,0 mmgroße Fragmente, um die Gewebeverdauung zu optimieren. Waschen Sie die Gewebefragmente mit Ca2+/Mg2+-freiem DBPS, ergänzt mit Antibiotika (Ca2+/Mg2+-freies DPBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/ml Amphotericin B/10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/ml Kanamycin), bis die Wäsche blutfrei ist. Führen Sie bei Bedarf mehrere Wäschen durch. Entsorgen Sie die Wäsche, indem Sie die Wäsche vorsichtig durch eine sterile Gaze in ein Abfallbecherglas filtrieren.
- Gewaschene Fragmente werden in einen 125-ml-Glaskolben mit rundem Boden mit einem 25-mm-Rührstab und vorgewärmtem Inkubationsmedium gegeben (Basalmedium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES-Puffer, 1 mg/ml Kollagenase Typ 1, 2 mg/ml Rinderserumalbumin in Zellkulturqualität). Verschließen Sie den Rundkolben mit Gummisepten.
- Führen Sie eine 20G-Spinalnadel in die Septen ein und verbinden Sie sie mit einem Gummischlauch mit einem Sauerstofftank. Um Verunreinigungen herauszufiltern, legen Sie Seidenpapier in den Schlauch, um einen Filter zu erstellen. Schalten Sie den Sauerstoffauslass auf niedrig ein. Führen Sie 10–15 Ausflussnadeln in die Septen ein, um einen Bruch der Septen zu vermeiden.
- Befestigen Sie das Set mit Klammern auf einem Ringstativ und legen Sie es für 30–45 min in ein auf 37 °C kalibriertes Wasserbad mit Rührplatte. Nachdem das Gewebe 15 Minuten lang inkubiert wurde, entfernen Sie 50 μl Inkubationsmedium und prüfen Sie visuell auf dissoziierte Drüsen. Wenn die Drüsen nicht dicht sind oder sich nicht vom Gewebe getrennt haben, lassen Sie es weitere 5-10 Minuten einwirken.
- Unmittelbar nach der Inkubation 50 ml vorgewärmtes DMEM/F-12 mit einer sterilen serologischen Pipette oder durch direktes Eingießen in die Inkubationsmischung in das Inkubationsmedium geben.
- Filtrieren Sie das Drüsengemisch durch eine sterile Gaze in vier konische 50-ml-Röhrchen. Halten Sie das Filtrat 15 Minuten lang auf Eis, damit sich die extrahierten Drüsen am Boden des konischen Rohrs absetzen können. Achten Sie darauf, die abgesetzten Drüsen nicht zu stören; Entfernen und entsorgen Sie die oberen 40 ml des Überstands mit einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie die restlichen 10 ml in 10 ml DPBS, ergänzt mit Antibiotika
.
- Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig in 5 ml Zellkultur-Reagenzgläsern. 5 min bei 65 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer Pipette entfernen.
Anmerkung: Es ist entscheidend, diesen Schritt auf dem Eis durchzuführen und eine Polymerisation der Basalmembranmatrix während des Mischens zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Drüsendichte durch Probenahme auf 50 μl visuell zu überprüfen. Die optimale Dichte beträgt ~70% Konfluenz.
- Als nächstes plattieren Sie die Drüsen mit einer Pipette mit breiter Spitze in 50 μl der Basalmembranmatrix. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Anrichten.
- Damit die Basalmembranmatrix polymerisieren kann, 10 bis 15 Minuten bei 37 °C inkubieren. Wenn Sie in einer 12-Well-Kulturplatte plattieren, fügen Sie 1 ml hFGO-Medium hinzu (Advanced Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium/F-12-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/ml Amphotericin B/10 mg/ml Gentamicin, 50 mg/ml Kanamycin, 10 mM HEPES-Puffer, 1 mM n-Acteylcystin, 1 x N2, 1 x B27, 50 % Wnt-konditioniertes Medium, 20 % R-Spondin-konditioniertes Medium, ergänzt mit 100 ng/ml knochenmorphogenetischem Proteininhibitor, 1 nM Gastrin, 50 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 200 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10, 10 mM Nicotinamid und 10 μM Y-27632 ROCK-Inhibitor) pro Well. Wenn Sie keine 12-Well-Kulturplatte verwenden, fügen Sie genügend Medien hinzu, um die Basalmembran-Matrixblase einzutauchen.
- Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem mit 5 % CO2 befeuchteten Zellkultur-Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 4-5 Tage.
