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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Instrumenten, Nährmedien und Schalen
- Autoklavieren Sie eine Darmschere, eine normale Schere und eine Pinzette in einem sterilen Behälter.
- Stellen Sie eine 96-Well-Schale (flacher Boden) in einen Inkubator bei 37 °C.
- Bereiten Sie 10 ml vollständiges Kulturmedium mit den in der Materialtabelle aufgeführten Reagenzien vor.
- Das gesamte Medium wird bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.
- Tauen Sie die rekonstituierte Basalmembran auf, indem Sie sie in einen Eiskübel legen. Die rekonstituierte Basalmembran wird bei 4 °C flüssig.
- Füllen Sie vier Petrischalen mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS (4 °C).
2. Isolierung von Dünndarmkrypten
- Opferung durch CO2 -Inhalation einer Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 Maus auf einem C57BL6/J Hintergrund. Präparieren Sie das Bauchfell in Längsrichtung mit einer Schere.
- Halten Sie den Magen mit der Pinzette fest und schneiden Sie ihn quer in zwei Hälften.
- Ziehen Sie von nun an mit der Darmschere den Darm heraus und legen Sie ihn in eine Petrischale, die PBS enthält.
Anmerkung: Eine Darmschere hat eine scharfe und stumpfe Spitze. Die stumpfe Spitze dieser Schere soll die Krypten-Zotten-Architektur beim Öffnen des Darms nicht beschädigen.
- Beginnen Sie damit, die stumpfe Spitze in den Magen zu stecken und schieben Sie sie vorsichtig durch den Pylorus. Fahren Sie fort, indem Sie mit der Schere schneiden und mit der Pinzette ziehen.
- Sobald der gesamte Dünndarm in Längsrichtung geöffnet ist, waschen Sie ihn in kaltem PBS, indem Sie ihn mit der Pinzette festhalten, und spülen Sie ihn vorsichtig mit U-förmigen Bewegungen in der PBS-Lösung aus.
- Sobald alle Stuhlreste entfernt sind, fahren Sie damit fort, den Darm auf einem Schneidebrett mit der leuchtenden Seite nach oben flach zu drücken. Die luminale Seite ist leicht an der Abwesenheit von Blutgefäßen und an ihrem blassen Aussehen im Vergleich zum äußeren Teil zu erkennen.
- Entfernen Sie mit einem Objektträger vorsichtig die Zotten, indem Sie den abgeflachten Darm abkratzen. Führen Sie diesen Schritt zweimal über die gesamte Länge des Gewebes durch.
- Schneiden Sie den Dünndarm mit einer sterilen chirurgischen Klinge in 2-5 mm große Stücke.
- Legen Sie die Dünndarmfragmente in ein 50-ml-Röhrchen mit 10 mL eiskaltem PBS.
- Reinigen Sie die Gewebefragmente und entfernen Sie alle verbleibenden Verunreinigungen, indem Sie sie im PBS auf und ab pipettieren. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Schritt, bis der PBS vollständig frei ist.
- Fügen Sie 15 mL kaltes PBS hinzu, um das Gesamtendvolumen von PBS auf 25 mL zu bringen. 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben und 45 min auf einer Walze bei 4 °C inkubieren.
- Verwerfen Sie das PBS/EDTA.
- Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und lösen Sie die Krypten, indem Sie die Gewebefragmente hart auf und ab pipettieren (mindestens dreimal). Sammelt den Überstand ein.
- Wiederholen Sie Schritt 2.13 viermal. Fügen Sie Kulturmedium hinzu, um ein Endvolumen von 50 ml zu erreichen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (300 x g für 5 min).
- Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL Nährmedium und pelletieren Sie die Krypten durch Zentrifugation (80 x g für 3 min).