Extraktion einer intakten Niere aus einer Maus: Eine Technik zur Gewinnung einer Niere ohne Nierenkapsel aus Mausmodellen

Zusammenfassung

Quelle: Grainger, N. et al. Isolierung und Bildgebung von lebenden, intakten Schrittmacherregionen des Nierenbeckens von Mäusen durch Vibratom-Schnitte. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Nierenextraktion aus dem retroperitonealen Raum der Maus. Die entnommene Niere kann weiter mikropräpariert werden, um eine intakte Niere ohne Nierenkapsel und die umgebende Fettschicht zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Nieren-Dissektion

1. Betäubung von Mäusen durch Inhalation von 3–4% Isofluran in einer beatmeten Haube. Bestätigen Sie die Einleitung einer tiefen Anästhesie durch Verlust des Zehen- und/oder Schwanzklemmreflexes und euthanasieren Sie die Mäuse dann durch Zervixluxation.
2. Tragen Sie 70%iges Ethanol auf die Brust auf, um das Fell zu befeuchten. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer externen Präparierschere über einen Längsschnitt, wobei die Scherenklingen vom Tier weg abgewinkelt sind, um eine Schädigung der inneren Organe zu vermeiden.
3. Mit einer inneren Gewebezange und einer inneren Dissektionsschere den Darm einklemmen und von der Bauchdecke wegheben. Beim Anheben des Darms wird die Unterseite des Darms am proximalen Zwölffingerdarm und am distalen Dickdarm vom Körper befreit, um Zugang zum retroperitonealen Raum zu erhalten, der die Nieren enthält.
4. Sobald die Nieren freigelegt sind, extrahieren Sie sie einzeln. Kneifen und heben Sie das distale Ende des Harnleiters (~4 mm von der Niere entfernt) vorsichtig mit einer Gewebezange an. Schneiden Sie mit der Präparierschere unter dem eingeklemmten Harnleiter in Richtung Niere. Schneiden Sie weiter unter der Niere, bis sie sich vom umgebenden Bindegewebe befreit hat.
   Anmerkung: Um die Gewebeintegrität und die Konsistenz des Schnitts während des Vibratomus-Schnitts zu maximieren, muss die Niere so intakt wie möglich sein. Um dies zu gewährleisten, vermeiden Sie das Einklemmen oder Schneiden der Niere mit einer Pinzette und einer Präparierschere.
5. Legen Sie die Niere mit angeschlossenem Harnleiter in eine eiskalte KRB-Lösung. Wiederholen Sie die Extraktionsschritte mit der kontralateralen Niere, um sie aus dem Körper der Maus zu entfernen. Halten Sie die Nieren in KRB-Lösung auf Eis.
   HINWEIS: Fahren Sie sofort mit dem nächsten Abschnitt des Protokolls fort, um die Lebensfähigkeit des PKJ-Gewebes zu erhalten. Aufgrund seiner anatomischen Lage tief im Nierenparenchym ist der PKJ des Kontakts mit der KRB-Lösung beraubt.

2. Bereiten Sie die Niere ohne Nierenkapsel für den Vibratom-Schnitt vor

1. Übertragen Sie die Niere in eine mit Silikonelastomer beschichtete Sezierschale (60 mm x 15 mm) und füllen Sie sie mit eiskalter KRB-Lösung, bis die Niere vollständig untergetaucht ist.
2. Verankern Sie die Niere unter einem Präpariermikroskop am Boden der Schale, indem Sie winzige Stifte in den proximalen Harnleiter und durch die dünne vordere Nierenkapsel oder das umgebende Fettgewebe einführen.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, das Nierenparenchymgewebe nicht zu durchstechen.
3. Verwenden Sie eine feine Federschere und eine innere Pinzette, um das Fettgewebe von der Basis der Niere zu entfernen und das distale RP und den proximalen Harnleiter freizulegen.
4. Den proximalen Harnleiter und einen Teil des distalen RP mit einer feinen Federschere von der Basis des RP entfernen.
   Anmerkung: Achten Sie darauf, das umliegende Nierenparenchym nicht zu durchtrennen. Die schwarze gestrichelte Linie in Abbildung 1A zeigt die ungefähre Position dieses Schnitts. Dieser Schnitt schafft eine flache Basis an der Niere für eine gleichmäßigere Gewebeschnitte. Bei der Präparation der Niere muss man sich der anatomischen Lage der PKJ-Region bewusst sein. Abbildung 1B zeigt, dass die intakte Niere entlang einer sagittalen Ebene geschnitten werden kann, um die Medulla, die Papille (distale Mark, in der die Sammelkanäle zusammenlaufen) sowie das proximale und distale RP freizulegen. Würde die Papille vollständig freigelegt, wie in Abbildung 1C, können PKJ und proximale RP (prox RP) sichtbar gemacht werden. Dies sollte jedoch nicht für die Vibratom-Technik gemacht werden; Diese Beschreibung soll den Leser auf die PKJ-Lokalisation im Allgemeinen ausrichten, was in dem anatomischen Unterschied hervorgehoben wird, der in den Durchlichtbildern der PKJ-Region und der mittleren RP-Region in Abbildung 1D, E gezeigt wird.
5. Durchstechen Sie die äußere Nierenkapsel mit einer Pinzette mit feiner Spitze und winkeln Sie die Spitzen vom Nierenkörper weg ab. Drücken Sie mit einer Pinzette mit jeder Hand die losen Enden der Kapsel zusammen und schälen Sie sie. Fahren Sie fort, die verbleibende Membran der Nierenkapsel abzuschälen, bis sie vollständig entfernt ist.
   Anmerkung: Die Nierenkapsel ist eine zähe, faserige Schicht, die die Niere umgibt. Es muss vor dem Vibrationsschneiden entfernt werden, um einen optimalen Schnitt zu erzielen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Grundlegende Anatomie der Niere und Lage der PKJ-Schrittmacherregion.(A) Diagramm der intakten Niere, das die Ausrichtung des RP und des Harnleiters zeigt. Die Nierenarterie und die Nierenvene sind rot bzw. blau dargestellt. (B) Die intakte Niere kann entlang einer sagittalen Ebene geschnitten werden, um den inneren Aspekt der Niere freizulegen, einsc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
60 mm x 15 mm Petrischale	Sigma Aldrich	Nr. P5481	Nierenscharfe Sezierschale
Saugpapier	Fisher Scientific	06-666A	Zum Trocknen der Niere vor dem Auftragen Leim
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Das Jackson-Labor	Artikel-Nr.: 13148	GCaMP3-Mäuse
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Das Jackson-Labor	Artikel-Nr.: 24105	GCaMP6f-Mäuse
B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	Das Jackson-Labor	19079	smMHC-CRE-Mäuse
C57BL/6-TG(Pdgfra-cre)1Clc/J	Das Jackson-Labor	Artikel-Nr.: 13148	PDGFRa-CRE Mäuse
Ethanol	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	Zum Sezieren
Extrafeine Bonn Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14083-08	Wird für interne Präparierscheren verwendet
Feine Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 14060-09	Wird für externe Präparierscheren verwendet
Pinzette mit feiner Spitze	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11254-20	Wird für die feine Dissektion der Niere verwendet
Isofluran	Baxter	NDC-1001936060	Für die Anästhesie
Silikon-Elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
Student Adson Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	91106-12	Zum sanften Halten und Bewegen des Niere
Student Dumont Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	91150-20	Wird für interne Präparierzangen verwendet
Vannas Federschere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 15000-03	Zum scharfen Sezieren und Reinigen von isolierte Niere