Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Lösungen vorbereiten
- Bereiten Sie 1 l Krebs-Ringer-Bicarbonat (KRB)-Lösung vor, die 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3, 1,2 mM Na2, HPO 4,1,2 mM MgCl2, 11,5 mM Glukose und 2,5 mM CaCl2 enthält. Halten Sie die KRB-Lösung am Tag der Anwendung auf Eis.
Anmerkung: KRB kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden und sollte vor der Verwendung mindestens 10 Minuten lang mit einer Mischung aus 97 %O2 und 3 % CO2 vorgeblasen werden.
>2. Vibratom-Schnitt der Niere
- Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die vorbereitete Niere vorsichtig aus der eiskalten KRB-Lösung zu greifen und zu entfernen. Legen Sie die Niere sofort für ~2–4 s auf saugfähiges Papier, um überschüssige äußere Feuchtigkeit zu entfernen. Rollen Sie die Niere vorsichtig über das saugfähige Papier, um sicherzustellen, dass alle Seiten des Parenchyms getrocknet sind, damit die Niere optimal am Vibratomstadium haftet.
HINWEIS: Da sich das Nierenbecken innerhalb der Niere befindet und daher durch das äußere Parenchym geschützt ist, wäre diese kurze Trocknungszeit nicht nachteilig für die Integrität des Gewebes.
- Tragen Sie sofort eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber (~1 cm2) auf die Basis der Vibratom-Probenplatte auf und platzieren Sie die Niere mit einer stumpfen Pinzette mit der Harnleiterseite nach unten auf der mit Klebstoff bedeckten Stelle. Üben Sie mit dem flachen Rand der Pinzette etwa 10–20 s lang sanft Druck nach unten auf die Oberseite der Niere aus, um den Kleber zu trocknen.
Anmerkung: Um die Niere während dieses Eingriffs zu stabilisieren, verwenden Sie eine zusätzliche Pinzette, um die Niere aufrecht zu halten, während der Kleber trocknet. Es ist wichtig, dass die Niere in aufrechter Position an der Probenplatte haftet, damit die Schnitte gerade geschnitten werden. Um sicherzustellen, dass die Niere erfolgreich an der Probenplatte haftet, drücken Sie vorsichtig auf die Seite der Niere. Wenn die Niere erfolgreich an der Platte geklebt hat, sollte die Basis der Niere an der Platte befestigt bleiben.
- Befestigen Sie die Probenplatte fest am Boden der Pufferschale. Stellen Sie den Gehalt an KRB-Lösung so ein, dass die Oberseite der Niere vollständig eingetaucht ist. Wenn die Vibrationsklinge während der Trennschritte tiefer in die Pufferschale eindringt, entfernen Sie die KRB-Lösung, damit der Klingenhalter nicht in die Lösung eintaucht.
Anmerkung: Wenn der Kleber nicht vollständig getrocknet ist, bevor Sie mit diesem Schritt fortfahren, wandert der Kleber oft von der Basis nach oben auf das Nierenparenchym. Dieser überschüssige Kleber macht das Trennen variabler. Nehmen Sie in diesem Fall die Niere von der Platte und fahren Sie mit einem frischen Nierenpräparat fort.
- Für das automatische Vibrationsschneiden wählen Sie die Start- und Endposition des Vibrationsmesser-Schneidzyklus. Stellen Sie sicher, dass diese Positionen ~0,5 bis 1 cm von der Niere entfernt sind, um sicherzustellen, dass bei jedem Vorschieben der Klinge die gesamte Nierenebene durchtrennt wird.
- Bereiten Sie eine Multi-Well-Platte (24 oder 48 Wells) vor, indem Sie die Wells mit KRB-Lösung füllen, und legen Sie die Platte auf Eis.
Anmerkung: Nach der Generierung sollten einzelne Abschnitte in separaten Vertiefungen platziert werden, um die Schnitttiefe zu verfolgen.
- Starten Sie den automatischen Schneidvorgang. Achten Sie beim ersten Durchgang der Klinge darauf, dass die Klinge die Oberseite der Niere berührt. Wenn kein Kontakt hergestellt wird, stellen Sie die Start-Z-Position der Klinge ein.
- Entnehmen Sie mit einer Pinzette Abschnitte, die aus der Niere gelöst werden. Übertragen Sie die Schnitte sofort in die einzelnen Vertiefungen und notieren Sie die Z-Tiefe der Schnitte, um die ungefähre PKJ-Position innerhalb der Nierenschnitte zu messen.
Anmerkung: Abhängig von den Schnittparametern kann es vorkommen, dass einige Abschnitte nicht aus dem Nierenblock herausgeschnitten werden. Schneiden Sie in diesem Fall vorsichtig mit einer feinen Federschere Abschnitte aus dem Nierenblock ab. Die Benutzer werden auch ermutigt, Schnitte aktiv unter einem Lichtmikroskop zu visualisieren, während sie in einzelnen Vertiefungen frei schweben, um eine optimale Schnitteinstellung und Gewebeposition zu gewährleisten. Abschnitte, die den PKJ enthalten, werden typischerweise ~ 1000–1500 μm von der Oberseite der Niere abgeleitet.
- Setzen Sie das Schnittprotokoll fort, bis die PKJ-Regionen deutlicher werden. Im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" finden Sie eine Beschreibung der PKJ-Regionen im Verlauf der Abschnittsbildung.
- Optimieren Sie an dieser Stelle die Schnittparameter, um sicherzustellen, dass die Schnitte gleichmäßig vom Nierenblock befreit und intakt sind. Stellen Sie außerdem sicher, dass die PKJ-Regionen durchgehend und ununterbrochen sind, da gebrochene PKJ-Wände aufgrund des Kollapses keine adäquate Abbildung der Zellen innerhalb der Wand ermöglichen. Wenn Wände gebrochen werden, verringern Sie die Schnittgeschwindigkeit und erhöhen Sie die Schnittdicke und beobachten Sie die Schnitte weiterhin unter einem Lichtmikroskop, um die Schnittparameter fein abzustimmen.
- Die Abschnitte werden bis zum Beginn der Experimente bei 4 °C in KRB-Lösung gelagert.
