Blasentumor-Organoidmodell: Eine Methode zur orthotopen Transplantation von Blasenorganoiden in die Empfänger-Mausblase

Zusammenfassung

Quelle: Kim, Y. et al. Kultur, Manipulation und orthotope Transplantation von Maus-Blasentumor-Organoiden.J. Vis. Exp.(2020)

In diesem Video beschreiben wir die orthotope Transplantation von kultivierten Blasentumor-Organoiden in die Mausblase, um die Rolle der Organumgebung bei der Entwicklung von Tumoren zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Subkultur-Blasentumor-Organoide
 

HINWEIS: Die Passage von Blasentumor-Organoiden bei einem Durchmesser von 100–150 μm wird empfohlen.

1. Geben Sie 500 μl Kollagenase/Dispase in das Organoidmedium in einer 24-Well-Platte mit Tumororganoiden. Pipettieren Sie die Basalmembranmatrix und das Medium auf und ab. 20 min bei 37 °C inkubieren und die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen ernten.
   Anmerkung: Untersuchen Sie die aus der Basalmembranmatrix isolierten Organoide unter dem Mikroskop. Wenn sich die Organoide nicht von der Basalmembranmatrix lösen, verlängern Sie die Inkubationszeit oder pipettieren Sie mehrmals.
2. Fügen Sie 5 mL vorgewärmtes DMEM hinzu, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 3 min bei 4 °C und aspirieren Sie den Überstand.
3. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml vorgewärmtem 0,25 % Trypsin-EDTA und 10 μM Y-27632. 5 min in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren. Pipettieren Sie die Zellen kräftig auf und ab und neutralisieren Sie das Trypsin mit 5 ml DMEM mit 10% FBS.
4. Das Röhrchen bei 400 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand ansaugen.
5. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml vorgewärmtem Organoidmedium und zählen Sie die Anzahl der einzelnen Tumorzellen.

>2. Orthotope Transplantation eines Blasenorganoids (Abbildung 1A)

1. Bereiten Sie die Blasentumor-Organoide für die orthotope Transplantation vor
   1. Vor der Transplantation sollten die Blasentumor-Organoide wie oben beschrieben 5–7 Tage lang kultiviert werden.
   2. Geben Sie 500 μl Kollagenase/Dispase in einer 24-Well-Platte mit den Tumororganoiden in das Organoidmedium. Pipettieren Sie die Basalmembranmatrix und das Medium auf und ab. Inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 °C und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen.
   3. 5 mL vorgewärmtes DMEM zugeben, das Röhrchen bei 400 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand aspirieren.
   4. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 mL DMEM und geben Sie die Lösung in eine 90 mm Petrischale.
   5. Nehmen Sie unter einem Mikroskop die 10–100 Tumororganoide mit einer P200-Mikropipette auf und sammeln Sie sie in einem Mikroröhrchen auf Eis.
   6. Das Röhrchen bei 400 x g 3 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen.
   7. Halten Sie das Zellpellet auf Eis, bis die Mäuse für die Operation bereit sind.
2. Submuköse Blasenwandtransplantation
   1. Bereiten Sie eine 8 bis 10 Wochen alte männliche Nacktmaus (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) mindestens 1 Woche vor dem Experiment vor, damit sie sich an eine neue Umgebung gewöhnen kann. Injizieren Sie Enrofloxacin (5 mg/kg) subkutan 24 Stunden vor der Operation.
   2. Reinigen Sie die Oberfläche der Bank mit Wasser und Seife. Autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente vor dem chirurgischen Eingriff und führen Sie die Operation mit sterilen Instrumenten durch.
   3. Bewahren Sie die 29-G-Insulinspritze, die Pipettenspitzen und die Basalmembranmatrix auf Eis auf. Verabreichen Sie Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan vor der Verabreichung der Anästhesie.
   4. Betäuben Sie die Maus mit 4% Isofluran in einer Induktionskammer. Sobald die Vollnarkose erreicht ist, legen Sie die Maus in Rückenlage und halten Sie die Narkose durch Maskeninhalation von 2% verdampftem Isofluran aufrecht.
      Anmerkung: Wenn die Anästhesiezeit mehr als 30 Minuten beträgt, tragen Sie mit einem Wattestäbchen Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden.
   5. Tragen Sie Povidon-Jod mit steriler Gaze auf und wischen Sie es mit 70% Ethanol ab. Wiederholen Sie dies jedes Mal 3x mit einer neuen Gaze oder einem Wattestäbchen.
   6. Decken Sie den Anus und das Operationsfeld mit sterilen Einweg-OP-Abdecktüchern ab.
   7. Nehmen Sie mit einem Präpariermikroskop zur Vergrößerung mit einer sterilen chirurgischen Schere einen kleinen Querschnitt (kleiner als 1,5 cm) in die Haut und die Muskelwand des unteren Mittelstreifens des Bauches vor. Legen Sie die Blase aus der Bauchhöhle frei und stützen Sie sie mit mit Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen.
      Anmerkung: Wenn die Blase mit Urin gefüllt ist, drücke sanft auf die Blase, um sie etwas zu entspannen.
   8. Resuspendieren Sie die Organoid-Pellets in 80 μl Organoid-Medium, das 50 % hochkonzentrierte Basalmembranmatrix enthält (Tabelle 1 und Materialtabelle).
   9. Injizieren Sie die Organoid-Suspension mit der 29-G-Insulinspritze unter einem Präpariermikroskop in den vorderen Bereich der Blasenkuppel.
   10. Verschließen Sie die innere Schicht der Bauchdecke mit antibakteriellem resorbierbarem Naht und schließen Sie dann die äußere Schicht mit 4-0 Nylon-Nahtmaterial. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
   11. Lassen Sie die Maus 10–15 Minuten unter einem Infrarotstrahler ruhen. Überwachen Sie die Maus, bis sie wieder zu Bewusstsein und Beweglichkeit gelangt.
   12. Überprüfen Sie einen Tag nach der Operation den Allgemeinzustand der Maus und das Anastomosenleck. Verabreichen Sie Ketoprofen (5 mg/kg) einmal täglich für 3 Tage postoperativ und behandeln Sie Enrofloxacin (5 mg/kg) einmal täglich für 10 Tage postoperativ.
   13. Wenn die Inzisionsstelle verheilt ist (10–14 Tage nach der Operation), entfernen Sie die Nähte. Überwachen Sie das Wachstum des Mausblasentumors für 2-3 Wochen nach der Injektion des Tumororganoids.
   14. Wenn ein Wachstum des Blasentumors beobachtet wird, euthanasieren Sie die Maus durch Inhalation von Kohlendioxid und entnehmen Sie den gesamten Blasentumor. Waschen Sie es mit kaltem DPBS (Abbildung 1B).
   15. Um die Histologie des Blasentumors zu analysieren, färbt man den in Paraffin eingebetteten Abschnitt des Gewebes mit Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Färbung (Abbildung 1B).

Mäuseblasentumor Organoid Medium
Advanced DMEM/F-12 (Basic Medium)	10 mM HEPES (pH 7,4)
10 mM Nicotinamid	0,5x serumfreie Ergänzung
2 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid	1% Penicillin/Streptomycin
1 mM N-Acetyl-L-Cystein	50 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor der Maus
1 μM A 83-01

Tabelle 1: Zusammensetzung des Organoidmediums des Blasentumors.

Ergebnisse

Abbildung 1: Orthotope Transplantation von Blasentumor-Organoiden.(A) Schematische Darstellung der orthotopen Transplantation von Blasentumor-Organoiden auf eine Nacktmaus. (B) Repräsentative Bilder von Blasen und H&E-gefärbten Schnitten von Mäusen, die orthotopisch mit Blasentumor-Organoiden transplantiert wurden. Vergrößerte Ansichten der um...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konisches 15-ml-Röhrchen	Spl	50015
24-Well-Platte	Corning	Artikel-Nr.: 3526
29 G 1/2 Insulinspritze	Shina	B299473538
Konisches 50-ml-Röhrchen	Spl	Artikel-Nr.: 50050
Nr. A8301	Tocris	Nr. 2939	Bestandskonzentration: 25 mM
Absolutes Ethanol	Daejung	Tel.: 4023-2304
Resorbierbares Nahtmaterial	Henry Schein	Tel.: 039010
Erweitertes DMEM/F-12	Thermo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nackte Maus)	Der Charles-Fluss	Nr. 194
Kollagenase Typ I	Thermo	17100017	Stammkonzentration: 20 mg/mL
Kollagenase Typ II	Thermo	17100015	Stammkonzentration: 20 mg/mL
Kollagenase/Dispase	Sigma	10269638001	Stammkonzentration: 1 mg/mL
DMEM (Dulbeccos modifizierte Minimum Essential Media)	Gibco	Nr. 11965-118
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma	Nr. D8418
DPBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)	Welgene	LB 001-02
Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Wachstumsfaktor reduziert (GFR)	Corning	Artikel-Nr.: 354230	Verwendung für Organoidkulturen in Platten
Matrigel hohe Konzentration (HC)	Corning	354248	Verwendung für die Organoid-Transplantation
1,5 mL Mikroröhrchen	Axygen	MCT-150-C
Rasierklinge
Kochsalzlösung Puffer	JW Pharmazie
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200072
Ultrazentrifugations-Röhrchen	Beckman Coulter	331372
Y-27632 Dihydrochlorid	Abmole	Nr. M1817	Konzentration des Stoffes: 10 mM