Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Vorbereitung von Sonden
- Bereiten Sie Sonden aus Titan-Nickel-Legierungen (40 mm Länge; 0,2 mm Durchmesser) vor, die mit einem 7 mm Mix-Mode-Sorptionsmittel beschichtet sind. Die Anzahl der Sonden hängt von den Zeitpunkten ab, die während des gesamten Verfahrens anvisiert werden, und von der Anzahl der Wiederholungen (3 werden pro Zeitpunkt empfohlen).
Anmerkung: Die Länge und Art der Extraktionsphase kann je nach Art der Untersuchung, der Polarität der Metaboliten und der Probenmatrix angepasst werden.
- Bereiten Sie eine Reinigungsmischung aus 2:1 Chloroform:Methanol (v/v) vor. Pipettieren Sie 1,0 mL der Lösung in jedes 2,0 mL Glasfläschchen und setzen Sie eine Sonde, die zuvor durch die Kappe gestochen wurde, in jedes Fläschchen ein.
Anmerkung: Reinigen Sie vor dem Gebrauch alle Sonden, um kontaminierende Partikel zu entfernen.
- Stellen Sie die Fläschchen auf das Rührwerk und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 1.200 U/min ein. Stoppen Sie das Gerät nach 45 Minuten und spülen Sie die Beschichtungen mit Wasser in LC-MS-Qualität ab.
- Da die Beschichtungen zu ihrer Aktivierung einem Vorkonditionierungsschritt unterzogen werden müssen, ist ein Vorkonditionierungsgemisch aus 1:1 Methanol:Wasser (v/v) herzustellen. Pipettieren Sie 1,0 ml der Lösung in jedes 2,0-ml-Glasfläschchen und setzen Sie eine Sonde, die zuvor durch die Kappe gestochen wurde, in jedes Fläschchen ein.
- Stellen Sie die Fläschchen auf das Wirbelrührwerk und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 1.200 U/min ein.
- Stoppen Sie nach 60 Minuten das Rührwerk und spülen Sie die Beschichtungen mit Wasser in LC-MS-Qualität ab.
- Sterilisieren Sie Sonden gemäß dem Standard-Sterilisationsprotokoll für chirurgische Geräte.
>2. Extraktion
- Öffnen Sie die sterile Verpackung direkt vor der Probenahme, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten.
- Führen Sie zu jedem Zeitpunkt zwei Sonden für jeweils 10 Minuten direkt in die Nierenrinde ein. Die Beschichtung muss über die gesamte Länge von der Gewebematrix bedeckt sein. Es ist kein spezifischer Winkel erforderlich, aber in der Regel werden ca. 90 Grad verwendet.
Anmerkung: Der gesamte medizinische Eingriff folgt den Standardprotokollen einer bestimmten Einrichtung. Es werden keine Änderungen in Bezug auf die SPME-Probenahme in Betracht gezogen. Das Verfahren umfasst die folgenden sechs Zeitpunkte zur Probenahme: a) vor der Nierenresektion, in vivo vom Spender; b)–e) nach 1 h, 3 h, 5 h, 7 h Nierenperfusion, ex vivo in der Organkammer; f) nach der Reperfusion in vivo vom Empfänger.
- Ziehen Sie die Sonden zurück, indem Sie sie aus dem Gewebe herausziehen, und spülen Sie die Beschichtungen dann mit LC-MS-Wasser ab, um das restliche Blut von der Beschichtungsoberfläche zu entfernen. Spülen Sie von der Operationsstelle weg und unmittelbar nach der Entnahme der Sonden.
>3. Transport und Lagerung
- Legen Sie die Sonden in separate Durchstechflaschen und verschließen Sie diese.
- Legen Sie die Fläschchen für den Transport in eine mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff gefüllte Styroporbox.
- Lagern Sie die Proben in einem Gefrierschrank (-80 °C) oder beginnen Sie sofort mit dem Desorptionsschritt.
>4. Desorption
- Bereiten Sie Desorptionslösungen vor, die aus 80:20 Acetonitril:Wasser (v/v) für die metabolomische Analyse und 1:1 Isopropanol:Methanol (v/v) für die lipidomische Analyse bestehen.
- Pipettieren Sie 100 μl der Lösung in Einsätze, die in mit 2,0 mL markierte Fläschchen gegeben werden, und setzen Sie eine Sonde, die zuvor durch die Kappe gestochen wurde, in jedes Fläschchen ein.
- Stellen Sie die Fläschchen auf das Wirbelrührwerk und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 1.200 U/min für 120 min ein.
- Entfernen Sie die Sonden aus den Fläschchen. Die gewonnenen Extrakte sind nun bereit für die instrumentelle Analyse.
>5. LC-MS-Analyse
- Stellen Sie die Fläschchen mit den Extrakten in den Autosampler des LC-MS-Systems.
Anmerkung: Für diese Studie wurde die Flüssigkeitschromatographie (RP, HILIC) in Verbindung mit hochauflösender Massenspektrometrie und einem Orbitrap-Massenanalysator verwendet. Für die Parameter der metabolomischen Analyse fahren Sie mit Schritt 5.2 fort. Für die Parameter der Lipidomanalyse fahren Sie mit Schritt 5.6 fort.
- Verwenden Sie eine Pentafluorphenyl (PFP)-Säule (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) für die Umkehrphasentrennung.
- Stellen Sie die Durchflussrate auf 300 μl/min und die Temperaturen des Autosamplers und der Säule auf 4 °C bzw. 25 °C ein.
- Bereiten Sie mobile Phasen gemäß den folgenden Anteilen vor: mobile Phase A: Wasser:Ameisensäure (99,9:0,1, v/v) und mobile Phase B: Acetonitril:Ameisensäure (99,9:0,1, v/v). Stellen Sie den Fluss der mobilen Phase gemäß den folgenden Parametern ein: Beginn des Flusses der mobilen Phase (0–3 min): 100 % A, gefolgt von einem linearen Gradienten auf 10 % A (3–25 min), endend mit dem isokratischen Fluss von 10 % A bis 34 min, gefolgt von 6 Minuten Zeit für das Wiederherstellen des Gleichgewichts in der Säule.
- Verwenden Sie für die HILIC-Trennung eine HILIC-Säule (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200 A). Stellen Sie die Durchflussrate auf 400 μL/min ein.
- Bereiten Sie mobile Phasen nach folgenden Anteilen vor: mobile Phase A: Acetonitril:Ammoniumacetat-Puffer (9:1, v/v, effektive Salzkonzentration 20 mM), mobile Phase B: Acetonitril:Ammoniumacetat-Puffer (1:1, v/v, effektive Salzkonzentration 20 mM).
- Stellen Sie den Fluss der mobilen Phase gemäß den folgenden Parametern ein: Starten Sie den Fluss der mobilen Phase (0–3 min) bei 100 % A, halten Sie ihn für 3,0 min und fahren Sie dann innerhalb von 5 Minuten auf 100 % B hoch. Halten Sie ihn mit 100 % B bis 12 min, gefolgt von 8 Minuten Zeit für das Wiederherstellen des Gleichgewichts in der Säule.
- Stellen Sie den Scanbereich auf 85–1000 m/z ein. Stellen Sie die Parameter der HESI-Ionenquelle im positiven Ionisationsmodus ein auf: Sprühspannung 1.500 V, Kapillartemperatur 300 °C, Mantelgas 40 a.u., Hilfsgasdurchfluss 15 u., Temperatur der Sondenheizung 300 °C, S-Linsen-HF-Pegel 55 %.
- Führen Sie QC-Proben durch, die aus 10 μl jeder analysierten Probe bestehen (regelmäßig, alle 10–12 Proben), um die Geräteleistung zu überwachen.
- Für die Umkehrstromtrennung ist eine C18-Säule (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm) zu verwenden.
- Stellen Sie die Durchflussrate auf 200 μl/min und die Temperaturen des Autosamplers und der Säule auf 4 °C bzw. 55 °C ein. Bereiten Sie mobile Phasen nach folgenden Anteilen vor: mobile Phase A: H2O:MeOH (60: 40, v/v), 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM Essigsäure; mobile Phase B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM Ammoniumacetat und 1 mM Essigsäure.
- Stellen Sie den mobilen Phasenfluss nach folgenden Parametern ein: 0–1 min (20 % B), 1–1,5 min (20–50 % B), 1,5–7,5 min (50–70 % B), 7,5–13 min (70–95 % B), 13–17 min (95 % B), 17–17,1 min (95–20 % B), 17,1–23 min (20 %).
- Für die HILIC-Trennung verwenden Sie eine HILIC-Säule (100 x 2,1 mm, 3 μm).
- Stellen Sie die Durchflussrate auf 400 μl/min und die Temperaturen des Autosamplers und der Säule auf 4 °C bzw. 40 °C ein.
- Die mobilen Phasen sind in folgenden Anteilen vorzubereiten: mobile Phase A: ACN; mobile Phase B: 5 mM Ammoniumacetat in Wasser. Stellen Sie den Fluss der mobilen Phase nach folgenden Parametern ein: 0–2 min (96 % B), 2–15 min (96–80 % B), 15–15,1 min (80–96 % B), 15,1–21 min (96 % B).
- Stellen Sie die Parameter der HESI-Ionenquelle im positiven Ionisationsmodus auf Sprühspannung 3.500 V, Kapillartemperatur 275 °C, Mantelgas 20 a.u., Aux-Gas-Durchflussrate 10 u., Temperatur der Sondenheizung 300 °C, S-Lens-HF-Pegel 55 % ein.
- Führen Sie QC-Proben durch, die aus 10 μl jeder analysierten Probe bestehen (alle 10–12 Proben), um die Geräteleistung zu überwachen.
- Führen Sie die Datenerfassung in einer Software durch, die mit dem Gerät kompatibel ist.
>6. Datenanalyse
- Führen Sie Datenverarbeitung, vermeintliche Identifizierung und statistische Analyse mit einer Software durch, die speziell für die ungezielte Metabolomik- und Lipidomik-Analyse entwickelt wurde.
Anmerkung: Zur Visualisierung der Datenstruktur können Hauptkomponentenanalysen (PCA) und Box-Whisker-Plots erstellt werden.
