Extrazelluläre DNA-Färbung: Eine Methode zur Identifizierung extrazellulärer DNA in FFPE-Gewebeschnitten

Zusammenfassung

Quelle: O'Sullivan, K. M. et al. Überwachtes maschinelles Lernen zur Semi-Quantifizierung extrazellulärer DNA bei Glomerulonephritis. J. Vis. (2020)

Dieses Video beschreibt die Technik zur Färbung extrazellulärer DNA in FFPE-Gewebeschnitten. Die gefärbte extrazelluläre DNA kann quantifiziert werden, um die Wirksamkeit jeder therapeutischen Behandlung zu bestimmen, die zum Tod von Krebszellen führt.

Protokoll

>1. Färbung auf ecDNA mit DAPI und β-Aktin

1. Glasobjektträger für 60 min in einen Schiebegitter in den 60 °C Ofen legen.
2. Tauchen Sie die Objektträger jeweils 40 Minuten lang in zwei Lösungsmittelwechsel (Xylol oder Ersatz) in einen Abzug.
3. Rehydrieren Sie Objektträger in 100 % Ethanol, 100 % Ethanol und 70 % Ethanol für jeweils 5 Minuten. 5 min in Leitungswasser waschen.
4. Stellen Sie eine Heizplatte in einen Abzug und kochen Sie die Antigen-Rückgewinnungslösung (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9,0) in einen Schnellkochtopf. Sobald die Antigen-Entnahmelösung zu kochen beginnt, legen Sie die Objektträger mit einer Zange horizontal in den Topf und verriegeln Sie den Deckel. Kochen auf hoher Stufe (entspricht 15 psi oder 103 kPa) für 10 min.
   Anmerkung: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da er das interessierende Antigen zurückgewinnt, indem das Antigenepitop (über Formalinfixierung vernetzt) demaskiert wird, um eine Antikörper-spezifische Bindung des Epitops zu ermöglichen. Die anschließende Färbung funktioniert ohne sie nicht.
5. Nehmen Sie den Schnellkochtopf vom Herd und entfernen Sie den Deckel sofort, indem Sie mit kaltem Wasser auf den Deckel in einer Spüle klopfen. Lassen Sie die Objektträger 20 Minuten lang in der Antigen-Entnahmelösung äquilibrieren.
6. Waschen Sie die Objektträger zweimal für 5 Minuten in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) auf einem Orbitalschüttler.
7. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift Kreise um das Nierengewebe und achten Sie darauf, dass in dieser Zeit kein Gewebe austrocknet.
8. Blockieren Sie das Gewebe in 10 % Hühnerseren in 5 % Rinderserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 30 min, 60 μL pro Schnitt. Waschen Sie sich nach diesem Schritt nicht, sondern entfernen Sie die Blocklösung vorsichtig mit einer 60-μl-Pipette, lassen Sie die Schnitte nicht austrocknen.
9. Den primären Antikörpercocktail für β-Aktin verdünnt 1/1000 in 1 % BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μl pro Schnitt, auftragen und über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer bei 4 °C inkubieren.
10. Waschen Sie die Objektträger zweimal für 5 min in PBS (pH 7,4, 0,01 M) auf einem Orbitalschüttler.
11. Den Sekundärantikörper, Huhn Anti-Kaninchen 488 (1/200), 60 μL pro Abschnitt, verdünnt in 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 40 min bei RT auftragen.
12. Waschen Sie die Objektträger zweimal für 5 min in PBS (pH 7,4, 0,01 M) auf einem Orbitalschüttler.
13. Tauchen Sie die Objektträger 30 Minuten lang in 0,3 % Sudan Black in 70 % Ethanol in ein Coplin-Glas.
    Anmerkung: Dieser Schritt ist wichtig, da er die durch die Formalinfixierung verursachte Autofluoreszenz löscht.
14. Waschen Sie die Objektträger in Leitungswasser, um Niederschlag zu entfernen, und tauchen Sie sie dann 10 Minuten lang in PBS (pH 7,4, 0,01 M), um die Bildung von weiterem Sudan Black-Niederschlag zu verhindern.
15. Montieren Sie Objektträger mit drei 60-μl-Tropfen Eindecklösung mit DAPI auf konfokale Glasdeckgläser und versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack, indem Sie sie um den Umfang des Deckglases herum auftragen.
16. Lassen Sie die Objektträger 24 Stunden lang bei RT aushärten (damit DAPI eindringen kann) und lagern Sie sie dann bei 4 °C vor Licht geschützt.
    Anmerkung: Es ist wichtig, im Dunkeln zu bleiben, um ein Verblassen der Leuchtstoffsonden zu verhindern.
17. Bildträger mit einem konfokalen Laserscankopf, der an einem Mikroskop befestigt ist. Stimulieren Sie Objektträger mit dem Laser 405 für DAPI und dem Laser 488 für Beta-Aktin. Erfassen Sie Bilder mit einer Ebene von 1024 x 1024 Pixeln mit Hilfe der sequenziellen Linienerfassung und der 4-Linien-Mittelwertbildung, die für den Nachweis von ecDNA unerlässlich ist. Es wird ein 40x 1,0 NA Ölobjektiv verwendet.
    1. Bilden Sie mindestens 20 Glomeruli pro Probe ab. Speichern Sie Bilder als ND2-Dateien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin	Sigma	Nr. A2153	5%ige und 1%ige Lösungen werden in PBS hergestellt, können in loser Schüttung hergestellt und eingefroren werden - nach dem Auftauen entsorgen
Hühnchen Anti-Ziegen-IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	Nr. A-21468	Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge vor der Verwendung 1 Minute lang, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail zu vermeiden
Hühner-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	Nr. A-121468	Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge vor der Verwendung 1 Minute lang, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail zu vermeiden
Huhn Anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	Nr. A-21441	Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge vor der Verwendung 1 Minute lang, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail zu vermeiden
Sera für Hähnchen	Sigma	Nr. C5405	Gebildet in 1% BSA/PBS
Deckgläser 24x60 mm	Aserbaidschant	ES0107222	#1.5 Dies ist keine Standarddicke, die für die Verwendung in der konfokalen Mikroskopie entwickelt wurde
EDTA 10mM	Sigma	Nr. E6758	TRIS und EDTA zusammen in destilliertem Wasser und einem pH-Wert von 9 für die Antigengewinnung hinzufügen, kann in einer 10x-Lösung aufbereitet werden
Ethanol 30%, 70% und 100%	Chem Versorgung	UN1170	Lieferung als 100 % unvergälltes Ethanol - mit destilliertem Wasser auf 30 % und 70 % verdünnt
Formaldehyd, 4% (10% neutrales gepuffertes Formalin)	Trajan	NBF-500	Die Niere wird 16 Stunden lang bei RT in ein 5-ml-Röhrchen mit 3 ml Formalin gegeben, Formalin sollte in einem Abzug verwendet werden
Histologie-Objektträger aus Glas - Ultra Super Frost, Menzel Glasur, 25x75 x1,0 mm	Trajan	J3800AM4	Die Verwendung von positiv geladenen beschichteten Objektträgern ist unerlässlich. Wir empfehlen nicht, Poly-L-Lysin für die Beschichtung von Objektträgern zu verwenden, da sich das Gewebe während des Antigen-Entnahmeschritts von den Objektträgern
Ziegen-Anti-Mensch/Maus-MPO-Antikörper	Forschung und Entwicklung	Nr. AF3667	Aliquotieren und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Hydrophober Stift	VECTOR Labore	H-400	Verwenden Sie diese Option, um einen Kreis um das Nierengewebe zu zeichnen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	Nr. P38135	0,01 M PB/0,09 % NaCl Make up 5 L auf einmal
Schnellkochtopf 6L Tefal Secure 5 Neo Edelstahl	Tefal	GSA-P2530738	Gekauft im örtlichen Haushaltswarengeschäft
Verlängern Sie Gold DAPI	Lebenstechnologien	Nr. P36962	Tropfen direkt auf das Deckglas auftragen
Kaninchen Anti-Mensch/Maus Beta Aktin Antikörper	ABCAM	AB8227	Aliquotieren und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Kaninchen Anti-Mensch/Maus H3Cit Antikörper	ABCAM	AB5103	Aliquotieren und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Färbegestell 24 Objektträger	ProScitech	Nr. H4465	Der gewählte Beizrost muss dem Kochen unter Druck und der Inkubation im 60-Grad-Ofen standhalten können
Sudan Schwarz B	Sigma	199664	0,3% 3g in eine 1L Flasche mit 70% Ethanol geben, filtrieren und vor Licht schützen - 6 Monate bei Raumtemperatur stabil
Tris 10mM	Sigma	Nr. T4661	TRIS und EDTA zusammen in destilliertem Wasser und einem pH-Wert von 9 für die Antigengewinnung hinzufügen, kann in einer 10-fachen Lösung hergestellt werden
Xylol	Trajan	XL005/20	Muss in einem Abzug verwendet werden