Ableitung humaner Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen: Ein Verfahren zur gerichteten Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Burt, M. et al. gesteuerte Differenzierung von reifen Nierenpodozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video beschreiben wir das Protokoll zur Ableitung von humanen Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen durch Zelldifferenzierung unter definierten chemischen Bedingungen. Die generierten Podozyten können für Nephrotoxizitätstests und die Modellierung von Krankheiten verwendet werden.

Protokoll

>1. Vorbereitung von Reagenzien

1. Verdünnen Sie aufgetautes 5x hiPS-Zellkulturmedium (CCM) in hiPS-Zellkultur-Basalmedium, um eine 1x Lösung von hiPS CCM zu erhalten.
   Anmerkung: Gefrorenes 5x hiPS CCM-Präparat erfordert einen langsamen Auftauprozess, idealerweise bei 4 °C über Nacht. Aliquots des 1x hiPS CCM können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
2. Vorbereitung von Basalmembran (BM) Matrix 1-beschichteten Platten für die hiPS-Zellkultur: BM Matrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen sind die Aliquote mit den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungsfaktoren zu erstellen.
   Anmerkung: Typischerweise werden Aliquots für die anschließende Verdünnung in 25 mL kaltem DMEM/F12 in einem konischen 50-ml-Röhrchen vorbereitet, gefolgt von gründlichem Mischen, um die BM-Matrix 1 vollständig aufzulösen und die Bildung von Restkristallen zu vermeiden.
3. Übertragen Sie 1 ml der BM-Matrix-1-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie sie 1–2 h lang bei 37 °C oder mindestens 24 h lang bei 4 °C, eingewickelt in Paraffinfolie. Die BM matrix 1-beschichteten Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
4. Vorbereitung von Basalmembran (BM)-Matrix 2-beschichteten Platten: Verdünnen Sie geeignete Mengen BM-Matrix 2 in sterilem destilliertem Wasser von 9 mL, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml herzustellen. Geben Sie 700 μl der BM-Matrix-2-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
5. Bereiten Sie jeweils 100 μg/ml-Stammlösungen aus BMP7, Activin A und VEGF wie folgt vor: Rekonstituieren Sie BMP7 in sterilem destilliertem Wasser mit 0,1 % (Gew./Vol.) BSA und rekonstituieren Sie Activin A und VEGF separat in sterilem PBS mit 0,1 % (Gew./Vol.) BSA. Um häufige Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden, bereiten Sie 100 μl Aliquote aus jeder Stammlösung vor und lagern Sie sie bis zu 6 Monate lang bei -20 °C.
6. Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Y27632 vor, indem Sie 10 mg Y27632 in 3,079 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen. Aliquotieren Sie 100 μl aus dem Lager und lagern Sie es bei -20 °C für bis zu 6 Monate.
7. 2 mg CHIR99021 in 143,4 μl sterilem DMSO lösen, um eine 30 mM Stammlösung herzustellen. 5 μl Aliquots vorbereiten und bis zu 1 Monat (oder gemäß Herstellerempfehlung) bei -20 °C lagern.
8. Löse 10 mg all-trans-Retinsäure in 3,33 ml sterilem DMSO. Bereiten Sie 500 μl Aliquots vor und lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei -20 °C.

>2. Vorbereitung von Nährmedien

1. Bereiten Sie das Mesoderm-Differenzierungsmedium vor, indem Sie entsprechende Stammlösungen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 und 1x B27 serumfreies Supplement in einem geeigneten Volumen von DMEM/12 mit Glutamin-Supplement rekonstituieren.
   Anmerkung: Das Mesoderm-Differenzierungsmedium sollte vor den Differenzierungsschritten frisch und in einem für den Maßstab des Experiments geeigneten Volumen hergestellt werden (typischerweise sind 50 ml Medium ausreichend für zwei 12-Well-Platten).
Bereiten Sie ein
2. intermediäres Mesoderm-Differenzierungsmedium her, indem Sie entsprechende Stammlösungen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml BMP7, 3 μM CHIR99021 und 1x B27 serumfreies Supplement in DMEM/F12 mit einem Glutamin-Supplement rekonstituieren.
   Anmerkung: Bei Bedarf kann das Medium mit 1% (vol/vol) Penicillin-Streptomycin ergänzt werden. Passen Sie das Volumen des Mediums an, indem Sie DMEM/F12 mit Glutaminzusatz verwenden. Dieses Medium kann in großen Chargen hergestellt werden; Es wird jedoch empfohlen, in kleineren Aliquoten (z. B. 45 mL in konischen 50-ml-Röhrchen) zu lagern, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Dieses Medium kann bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert werden und kann vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden.
3. Bereiten Sie das Podozyten-Induktionsmedium vor, indem Sie 100 ng/ml BMP7, 100 ng/ml Activin A, 50 ng/ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfreies Supplement und 0,1 μM all-trans-Retinsäure in DMEM/F12 mit Glutamin-Supplement zu einer Endkonzentration rekonstituieren. Medium vor Licht schützen (z. B. durch Umwickeln des Behälters mit Folienpapier).
   Anmerkung: Dieses Medium kann in großen Chargen hergestellt und im Dunkeln bei -20 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Gefrorene Aliquots sollten vor der Verwendung über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden.
4. Bereiten Sie 25 ml Trypsin-Neutralisationslösung vor, indem Sie 10 % (vol/vol) hitzeinaktiviertes FBS in DMEM/F12 hinzufügen und unter sterilen Bedingungen filtrieren.
5. Für die Nachdifferenzierung der aus Stammzellen gewonnenen Podozyten bereiten Sie Complete Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedium vor, indem Sie das Supplement gemäß den Richtlinien des Herstellers zum Basalmedium hinzufügen und bis zu zwei Wochen bei 4 °C lagern.

>3. Feeder-freie hiPS-Zellkultur mit hiPS-Zellkulturmedium

1. Aspirieren Sie die Restlösung der BM-Matrix 1 aus den vorbeschichteten Platten und waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal mit 1 bis 2 mL erwärmtem DMEM/F12.
2. Aspirieren Sie verbrauchtes hiPS-CCM aus den hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 Mal mit erwärmtem DMEM/F12. Fügen Sie 1 ml warme Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie 1 Minute lang bei 37 °C, um die Dissoziation der Zellen zu unterstützen. Führen Sie eine visuelle Inspektion der Zellen unter einem Gewebekulturmikroskop durch und stellen Sie sicher, dass die Ränder der Zellkolonien abgerundet erscheinen, und saugen Sie dann schnell die Zellablösungslösung aus den Zellen ab (um sicherzustellen, dass die Zellkolonien immer noch an der Platte haften, wenn auch locker). Spülen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit DMEM/F12 aus, um die Zellablösungslösung zu entfernen.
3. Geben Sie 3 ml hiPS CCM zu den hiPS-Zellen (in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte), die mit der Zellablösungslösung behandelt wurden. Kratzen Sie die Kolonien mit einem Zellheber ab und pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um die lose anhaftenden Zellen zu entfernen. Waschen Sie die Platte gründlich, um sicherzustellen, dass alle Zellen geerntet werden.
   Anmerkung: Die Verwendung einer 5-ml-Pipette wird empfohlen, um eine übermäßige Scherung der Zellen zu vermeiden.
4. Übertragen Sie 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer neuen BM Matrix 1-beschichteten 6-Well-Platte, die 2 ml hiPS CCM pro Vertiefung enthält. Bewegen Sie die Platte in Form einer Acht, um die Zellkolonien in den Vertiefungen zu verteilen, und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator. Das Medium wird täglich aufgefrischt, bis die Zellen bereit sind, durchgelassen oder für das Differenzierungsexperiment verwendet zu werden (ca. 70 % Konfluenz).
   Anmerkung: Die ideale Koloniegröße für die routinemäßige Passage von iPS-Zellen liegt zwischen 200 und 500 μm unter feederfreien Bedingungen mit hiPS CCM (ohne ROCK-Inhibitor). Wenn Zellen während der Behandlung mit Dissoziationsenzymen oder Puffern individualisiert werden, kann das hiPS-CCM mit einem ROCK-Inhibitor (z. B. 10 μM Y27632) ergänzt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.

>4. Differenzierung von hiPS-Zellen in Mesodermzellen (Tage 0–2)

1. Während sich die hiPS-Zellkulturen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden (ca. innerhalb von 4 Tagen nach der Kultur nach der Passage und etwa 70% Konfluenz), wird visuell auf das Vorhandensein von spontan differenzierten Zellen innerhalb und um die Ränder der Kolonien untersucht. Bei Bedarf Differenzierungsbereiche aseptisch abkratzen.
2. Aspirieren Sie hiPS CCM aus hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 Mal mit warmem DMEM/F12. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 mL enzymfreiem Zelldissoziationspuffer für 10 min bei 37 °C und überprüfen Sie die Dissoziation unter einem Mikroskop. Aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen verschiedenen hiPS-Zelllinien muss die tatsächliche Inkubationszeit für den Zelldissoziationspuffer für eine gegebene Zelllinie bestimmt werden.
3. Kratzen Sie die Vertiefung vorsichtig mit einem Zellheber ab, um lose anhaftende Zellen zu entfernen, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen, gefolgt von mehrmaligem Auf- und Abpipettieren, um die hiPS-Zellen zu individualisieren.
   1. Die Zellsuspension mit warmem DMEM/F12 auf ein Volumen von 15 mL bringen und 5 min bei 290 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   2. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie die Zellen mit warmem DMEM/F12 für eine weitere Zentrifugationsrunde, um die verbleibende BM-Matrix 1 und die Dissoziationspufferkomponenten zu entfernen.
4. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Mesoderm-Induktionsmedium wie oben beschrieben. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Scharzähler, um das geeignete Volumen des Mesodermdifferenzierungsmediums zu bestimmen, das zum Erreichen einer Konzentration von 1 x 10⁵ Zellen/ml erforderlich ist.
5. Aspirieren Sie die ECM-Lösung aus den BM matrix 2-beschichteten Platten und spülen Sie die Platten zweimal mit warmem DMEM/F12 aus. Mischen Sie die hiPS-Zellsuspension vorsichtig, indem Sie sie einige Male pipettieren. Übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der BM Matrix 2-beschichteten 12-Well-Platten und schütteln Sie die Platten dann vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.
6. Die Platte wird bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator inkubiert. Frischen Sie das Mesoderm-Induktionsmedium am nächsten Tag auf.
   Anmerkung: Nach 2 Tagen wären aus hiPS-Zellen gewonnene Mesodermzellen bereit für die intermediäre Mesoderminduktion.

>5. Differenzierung von aus hiPS-Zellen gewonnenen Mesodermzellen in intermediäre Mesodermzellen (Tage 2–16)

1. An Tag 2 des Differenzierungsprotokolls das Mesoderm-Induktionsmedium aspirieren und mit 1 ml intermediärem Mesoderm-Induktionsmedium pro Vertiefung auffüllen.
2. Frischen Sie das Medium jeden Tag auf, um einen genauen Schwellenwert für Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle für die stoffwechselaktiven Zellen aufrechtzuerhalten. Bei erheblichem Zellwachstum und rascher Erschöpfung der Mediennährstoffe (erkennbar an der Gelbfärbung des Mediums), kann das Volumen des intermediären Mesoderm-Differenzierungsmediums auf 1,3 ml pro Vertiefung der 12-Well-Platten erhöht werden.
3. Kulturieren Sie Zellen für weitere 14 Tage, um intermediäre Mesodermzellen zu erhalten. Bis zum 16. Tag können diese Zellen für die spätere Verwendung kryokonserviert werden.

>6. Differenzierung von intermediären Mesodermzellen aus hiPS-Zellen in Podozyten (Tage 16–21)

1. Spülen Sie die intermediären Mesodermzellen mit warmem DMEM/F12 und inkubieren Sie die Zellen anschließend 3 Minuten lang bei 37 °C mit 0,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA pro Well. Führen Sie eine Sichtprüfung durch, um sicherzustellen, dass die Zellen zu dissoziieren beginnen.
2. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber ab und pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze, um individualisierte (oder kleine Klumpen von) Zellen zu erhalten.
   Anmerkung: Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass die Zellen vollständig dissoziiert sind, da aggregierte Zellen möglicherweise nicht in der Lage sind, innerhalb des Zeitrahmens des Protokolls einen terminalen differenzierten Phänotyp zu erwerben.
3. Fügen Sie etwa 2 ml Trypsin-Neutralisationslösung pro Vertiefung hinzu, um die Aktivität von Trypsin zu stoppen.
4. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen mit DMEM/F12 auf 50 mL, und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 201 x g bei Raumtemperatur.
5. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im Podozyten-Induktionsmedium. Für optimale Ergebnisse stellen Sie eine endgültige Aussaatdichte von ca. 100.000 Zellen/Well einer 12-Well-Platte sicher. Geben Sie die Zellsuspension in die mit BM matrix 2 beschichteten Platten und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.
6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ und frischen Sie das Medium täglich bis zu 5 Tage lang auf, um bis zum Tag Podozyten zu erhalten 21.
   Anmerkung: Die resultierenden Podozyten aus hiPS-Zellen können für 2–4 weitere Wochen in Kultur aufbewahrt werden, indem ein vollständiges Medium mit Podozytenerhaltungsmedien verwendet wird. Sobald sich die Zellen in Podozyten-Erhaltungsmedien befinden, können sie jeden zweiten Tag gefüttert und für nachfolgende Studien oder nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellen
DU11 humane iPS-Zellen			Die iPS-Zelllinie DU11 (Duke University Clone #11) wurde in der iPSC Core Facility der Duke University erzeugt und uns vom Bursac Lab an der Duke University zur Verfügung gestellt. Diese Linie wurde auf Mykoplasmen getestet und zuletzt im Juli 2019 von unserem Labor karyotypisiert und für karyotypisch normal befunden.
Wachstumsfaktoren und Medienergänzungen
All-trans-Retinsäure (500 mg)	Artikel-Nr.: 72262	Technologien für Stammzellen
B27 serumfreies Nahrungsergänzungsmittel	17504044	Thermo-/Life-Technologien
CHIR99021	Tel.: 04-0004	Stemgent	Kann Schwankungen von Los zu Los aufweisen
Komplettes Medium Kit mit CultureBoost-R	4Z0-500-R	Zell-Systeme	Podocyte Pflegemedien
DMEM/F12	12634028	Thermo-/Life-Technologien
DMEM/F12 mit GlutaMAX Ergänzung	10565042	Thermo-/Life-Technologien	DMEM/F12 mit Glutamin-Ergänzung
Hitzeinaktiviertes FBS	10082147	Thermo-/Life-Technologien
Humanes Activin A	PHC9564	Thermo-/Life-Technologien
Menschliches BMP7	PHC9544	Thermo-/Life-Technologien
Menschliches VEGF	PHC9394	Thermo-/Life-Technologien
mTeSR1 mittel	Tel.: 05850	Technologien für Stammzellen	hiPS-Zellkulturmedien (CCM)
Penicillin-Streptomycin, flüssig (100×)	Nr. 15140-163	Thermo-/Life-Technologien
Y27632 ROCK-Inhibitor	Nr. 1254	Tocris
Antikörper
Alexa Fluor 488- und Alexa Fluor 594-konjugierte Sekundärantikörper	Nr. A32744; Nr. A32754; Nr. A-11076; Nr. A32790	Thermo-/Life-Technologien
Brachyury(T)	AB20680	Abcam (Englisch
Nephrin	GP-N2	Nachkommen
OKT4	Nr. AF1759	F&E-Systeme
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
ECM-Moleküle
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) Fragment	Nr. N-892012	Iwai Nordamerika	Basalmembran (BM) Matrix 2
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, 5 mL Fläschchen	354277	BD Biowissenschaften	Basalmembran (BM) Matrix 1. Kann Schwankungen von Los zu Los aufweisen
Enzyme und andere Reagenzien
Accutase	A1110501	Thermo-/Life-Technologien	Lösung zur Zellablösung
Bsa	Nr. A9418	Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Nr. D2438	Sigma-Aldrich	DMSO ist giftig. Sollte in der Chemikalienschutzhaube gehandhabt werden
Enzymfreier Zelldissoziationspuffer, Hank's ausgewogenes Salz	13150016	Thermo-/Life-Technologien
Ethanollösung, 70 % (vol/vol), biotechnologische Qualität	Artikel-Nr.: 97065-058	VWR	Ethanol ist brennbar und giftig
FBS	431097	Corning
Paraformaldehyd (PFA)	Artikel-Nr.: 28906	Thermo-/Life-Technologien	PFA sollte in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille gehandhabt werden. Vermeiden Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Nr. 14190-250	Thermo-/Life-Technologien
Steriles destilliertes Wasser	15230162	Thermo-/Life-Technologien
Triton X-100	Artikel-Nr.: 97062-208	VWR
Trypsin-EDTA, 0,05 %	Nr. 25300-120	Thermo-/Life-Technologien
Ausrüstung
Aspirationspipetten, einzeln verpackt	Tel.: 29442-462	Corning
Avanti J-15R Zentrifuge	Nr. B99516	Beckman Coulter
Konisches Zentrifugenröhrchen, 15 mL	352097	Corning
Konisches Zentrifugenröhrchen, 50 mL	352098	Corning
Kryoboxen	3395465	Thermo-/Life-Technologien	Zur Lagerung von gefrorenen Aliquoten
EVOS M7000	AMF7000	Thermo-/Life-Technologien	Fluoreszenzmikroskop zur Aufnahme von Bildern von fixierten und gefärbten iPS-Zellen und deren Derivaten
Hämozytometer	Artikel-Nr.: 100503-092	VWR
Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator	51030403	Thermo-/Life-Technologien	Für die routinemäßige Kultivierung und Pflege von iPS-Zellen und deren Derivaten
Invertierter Zeiss Axio Observer ausgestattet mit AxioCam 503 Kamera	491916-0001-000 (Mikroskop) ; 426558-0000-000 (Kamera)	Carl Zeiss Mikroskopie	Wird verwendet, um Phasenkontrastbilder von lebenden iPS-Zellen und ihren Derivaten in jedem Stadium der Podozytendifferenzierung
Kimberly-Clark Handschuhe aus Nitril	Tel.: 40101-346	VWR
Kimwipes, groß	Artikel-Nr.: 21905-049	VWR
Kimwipes, klein	Artikel-Nr.: 21905-026	VWR
P10 Präzisions-Barriere-Pipettenspitzen	P1096-FR	Denville Scientific
P100 Barriere-Pipettenspitzen	Nr. P1125	Denville Scientific
P1000 Barriere-Pipettenspitzen	Nr. P1126	Denville Scientific
P20 Barriere-Pipettenspitzen	Nr. P1121	Denville Scientific
P200 Pipettenspitzen mit Barriere	Nr. P1122	Denville Scientific
Serologische Pipette, 10 mL, einzeln verpackt	356551	Corning
Serologische Pipette, 25 mL, einzeln verpackt	356525	Corning
Serologische Pipette, 5 mL, einzeln verpackt	356543	Corning
Steriflip, 0,22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Sterile Mikrozentrifugenröhrchen	Artikel-Nr.: 1138W14	Thomas Wissenschaftlich	Zur Aliquotierung von Wachstumsfaktoren
Mit Gewebekulturen behandelte 12-Well-Platten	353043	Corning
Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten	353046	Corning
VWR weißer Techuni-Laborkittel	Tel.: 10141-342	VWR
Breit abgeschrägter Küvettenheber	3008	Corning