Isolierung von Detrusor-Zellen der glatten Muskulatur: ein enzymatisches Verdauungsverfahren zur Gewinnung von DSM-Zellen aus menschlichen Harnblasenproben

Zusammenfassung

Quelle: Malysz, J. et al. Präparation und Verwendung von frisch isolierten humanen Detrusor glatten Muskelzellen zur Charakterisierung von 9-Phenanthrol-empfindlichen Kationenströmen. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von glatten Detrusor-Muskelzellen aus menschlichen Harnblasenproben mit Hilfe einer zweistufigen sequentiellen enzymatischen Behandlung.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Dissektion von DSM-Geweben und Präparation von mukosafreien DSM-Stücken

1. Untersuchen Sie die Harnblasenprobe in voller Dicke, die aus dem Operationssaal im Labor eintraf, in einem dicht verschlossenen Behälter, der mit der kalten Dissektions-/Aufschlusslösung gefüllt war (Abbildung 1 und Tabelle 1 für die Zusammensetzung von DS).
   Anmerkung: Die Probe wird in der Regel von einigen Stunden bis über Nacht in kaltem DS aufbewahrt, bevor sie im Labor ankommt. Für eine längere Lagerung wird DS (Tabelle 1) mit 1 mM CaCl₂ ergänzt.
2. Entnehmen Sie die DSM-Probe in voller Dicke des Menschen (die alle Schichten einschließlich Schleimhaut, DSM und Serosa enthält) und spülen Sie sie mit eiskaltem DS ab, um anhaftende Ablagerungen und Blut auszuwaschen.
3. Stecken Sie die Harnblasenprobe mit der Schleimhaut nach oben und der Serosa nach unten auf eine mit Silikonenantiomer beschichtete runde Schale mit einem Durchmesser von 150 mm, die mit eiskaltem DS gefüllt ist (Abbildung 1B).
4. Entfernen Sie das angrenzende Fettgewebe, die Blutgefäße, das Epithel (Urothel) und die Muscularis-Schleimhaut aus der Probe durch scharfe Dissektion mit Mikroschere und Pinzette.
5. Schneiden Sie mehrere schleimhautfreie DSM-Stücke (~2–3 mm lang und 4–6 mm breit) aus (Abbildung 1C).

>2. Enzymatische Dissoziation von DSM-Stücken, die frisch isolierte einzelne DSM-Zellen ergeben

1. Geben Sie 3 bis 6 DSM-Stücke in ein Röhrchen mit 1 bis 2 mL vorgewärmtem (~37 °C) DS, das Papain und Dithiothreitol enthält (DS-P, Tabelle 1) und inkubieren Sie DSM-Stücke in DS-P für 30–45 Minuten bei ~37 °C, wobei Sie das Röhrchen gelegentlich (einmal alle 10–15 Minuten) leicht schütteln.
   Anmerkung: Um die Temperatur für die enzymatische Behandlung optimal zu steuern, werden die Röhrchen mit Gewebestücken und Enzymlösungen entweder in eine mit Wasser gefüllte Glasgewebekammer gelegt, die mit einem zirkulierenden beheizten Wasserbad verbunden ist (Abbildung 1D) oder in einem hochpräzisen temperaturgesteuerten Schüttelwasserbad (Abbildung 1E).
2. DS-P aus der Tube nehmen, DSM-Stücke kurz mit eiskaltem DS waschen, kaltes DS aus der Tube entsorgen und DSM-Stücke am Boden der Tube belassen.
3. Geben Sie 1 bis 2 mL DS-haltige Kollagenase Typ II (DS-C, Tabelle 1) mit DSM-Stücken in das Röhrchen; mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie es 25–40 Minuten bei ~37 °C und schütteln Sie das Röhrchen gelegentlich (alle 10–15 Minuten).
4. Des-C entsorgen und enzymbehandelte DSM-Stücke 5–10 Mal mit eiskaltem DS waschen.
5. Lassen Sie die DS-Lösung nach dem letzten Waschen im Röhrchen und zerkleinern Sie sie mehrmals vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteurpipette, um einzelne DSM-Zellen freizusetzen.
6. Geben Sie einige Tropfen DS-Lösung, die dispergierte DSM-Zellen enthält, auf eine Glasbodenkammer oder ein Deckglas und überprüfen Sie die Qualität mindestens 5 Minuten nach der Anwendung unter einem Mikroskop (mit einem 20x- oder 40x-Objektiv), damit die Zellen am Boden haften können.
7. Verwenden Sie sofort frisch isolierte DSM-Zellen für elektrophysiologische Experimente oder lagern Sie die Zellen in einem Röhrchen mit DS bei ~4 °C entweder auf Eis oder im Kühlschrank bis zur Verwendung (typischerweise für bis zu 8 Stunden Zubereitung).
   Anmerkung: Innerhalb desselben Präparats variiert die Qualität der Zellen von hochlebensfähigen bis hin zu überverdauten, toten DSM-Zellen (Abbildung 2). Wenn die sequentielle Papain-Kollagenase-Methode eine sehr hohe Anzahl nicht lebensfähiger Zellen ergibt, wird das Präparat verworfen und ein neuer Verdau von DSM-Stücken durchgeführt, jedoch mit verkürzten Inkubationsintervallen. Ergibt sich durch das Verfahren zu wenige DSM-Zellen, werden für den anschließenden Verdau der DSM-Stücke die Inkubationsintervalle verlängert. Eine positive Immunreaktivität gegenüber α-glattem Muskelaktin bestätigt die Identität von DSM-Zellen (Abbildung 3).

Art der Lösung	Zusammensetzung (in mM)
DS (Dissektions-/Aufschlusslösung)	80 Na-Glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 und 11 Glukose, pH-Wert eingestellt auf 7,4 (mit 10 M NaOH)
DS-P (Papain-haltiges DS)	DS mit 1-2 mg/ml Papain, 1 mg/ml Dithiothreitol und 1 mg/ml Rinderserumalbumin
DS-C (Kollagenase-haltiges DS)	DS-Lösung mit 1-2 mg/ml Kollagenase Typ II, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 0 oder 1 mg/ml Trypsin-Inhibitor und 100-200 μMCa 2+
P (Pipette)	110 CsOH, 110 Asparaginsäure, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA und 30 CsCl, pH-Wert eingestellt auf 7,2 mit CsOH und ergänzt mit Amphotericin-B (300-500 μg/ml)
E (extrazellulär)	10 Tetraethylammoniumchlorid (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES und 10 Glukose, pH-Wert eingestellt auf 7,3-7,4 mit NaOH oder CsOH und 0,002-3 (2-3 mM) Nifedipin

Tabelle 1: Zusammensetzungen der Dissektions-/Verdauungslösung (DS) sowie der Pipette und der extrazellulären Lösungen, die in perforierten Patch-Clamp-Experimenten verwendet wurden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Zusammenfassung der Dissektionsschritte, die zur Präparation von Detrusorstücken der glatten Muskulatur (DSM) und zum Aufbau der enzymatischen Dissoziation führen. Gezeigt werden Bilder von: (A) einer menschlichen Harnblasenprobe in voller Dicke, die aus einer offenen Blasenoperation als fremdes chirurgisches Material in eiskaltem DS zur Verfügung ges...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5 ml Tube aus Polystyrol mit rundem Boden	Falke	352054	Röhrchen für DS, die Enzyme enthalten, die in Verdauungsschritten verwendet werden
Analoger Vortex-Mischer	VWR	Tel.: 58816-121
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	Nr. A7906	Ds
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C1016	Extrazelluläre Lösung und DS
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	Nr. E3889	Ca2+-Chelator, wird in intrazellulärer Pipettenlösung verwendet
Traubenzucker	Sigma	Nr. G8270
Kollagenase Typ 2	Worthington Biochemical Corporation	LS004177	DS-C
Cäsiumhydroxid-Hydrat	Sigma-Aldrich	Nr. C8518	Intrazelluläre Pipettenlösung
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Extrazelluläre und intrazelluläre Lösungen
DL-Dithiothreitol (DDT)	Sigma-Aldrich	Nr. D9779	Reduktionsmittel, die zusammen mit Papain verwendet werden
NaOH	Sigma-Aldrich	Nr. S8045
Nifedipin	Sigma-Aldrich	Nr. N7634	spannungsgesteuerter Ca2+-Kanalblocker vom Typ L
Schwimmendes Schaumstoffrohrgestell/-halter	VWR Scientific	Artikel-Nr.: 82017-634	Wird zum Halten von Röhrchen mit Enzymen zur Temperaturkontrolle verwendet
Glutaminsäure (Na-Salz)	Sigma-Aldrich	Nr. G1626	Ds
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003126	DS-P
MgCl2 (Hexahydrat)	Sigma-Aldrich	M2670	Extrazelluläre und intrazelluläre Lösungen
Kcl	Fisher Scientific	Nr. BP366-1	Extrazelluläre Lösung
NaCl	Sigma-Aldrich	Nr. S7653	Extrazelluläre und intrazelluläre Lösungen
Nichtmetallische Spritzennadel, MicroFil	WPI	MF-34G-5	Befüllen mit intrazellulärer Pipettenlösung
Pasteur-Pipette	FisherBrand	13-678-20A	Die Spitzen werden abgebrochen und feuerpoliert und für die Titration von enzymatisch behandelten Geweben verwendet, um einzelne DSM-Zellen aus Stücken zu lösen
HEPES	Sigma-Aldrich	Nr. H3375	pH-Puffer
Thermo Scientific Präzisions-Schüttelwasserbad (Modell 2870)	Thermo Scientific	unterbrochen	Wasserbad zur Temperierung des enzymatischen Aufschlusses als Alternative zum Aufbau eines Gewebekammer-Zirkulationsbads
Vinyl-Schläuche	ColePalmer	Tel.: 06405-3	Vielseitig einsetzbar, u.a. zum Verbinden von Gewebebädern mit zirkulierenden Wasserbädern
Wasser-Zirkulator-Bad, Haake D1 L	Haake	unterbrochen	Verbunden mit dem Gewebebad
ZeissAxiovert 40C inverses Mikroskop mit 10x und 40x Objektiven	Carl-Zeiss	unterbrochen	Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups