Amphotericin-B-vermittelte perforierte Patch-Clamp-Analyse: Eine elektrophysiologische Technik zur Untersuchung von Ionenströmen in Harnblasenzellen

Abstract

Quelle: Malysz, J. et al. Präparation und Verwendung von frisch isolierten humanen Detrusor glatten Muskelzellen zur Charakterisierung von 9-Phenanthrol-empfindlichen Kationenströmen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Charakterisierung von kationischen Strömen aus transienten Rezeptorpotential-Melastatin Typ 4 (TRPM4) Ionenkanälen in Detrusor-glatten Muskelzellen unter Verwendung der Amphotericin-B-vermittelten perforierten Patch-Clamp-Technik. Die Technik hilft bei der Bewertung der biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften von Ionenkanälen.

Protocol

1. Aufzeichnung von spannungsstufeninduzierten Kationenströmen von DSM-Zellen mit der perforierten Ganzzellen-Spannungs-Patch-Clamp-Technik von Amphotericin-B

1. Pipettieren Sie 0,25–1 ml Zellsuspension in eine Glasbodenkammer, die auf einem Tisch eines inversen Mikroskops sitzt, und lassen Sie die Zellen am Glasboden haften.
2. Nach einer Inkubation von mindestens 45 Minuten wird die Aufschlusslösung (DS) aus dem Bad entnommen und durch Superfusion durch die E-Lösung (Tabelle 1) ersetzt, wobei der Schwerkraftstrom der Lösung über den Einlassschlauch DS langsam durch die neue Lösung ersetzt, während der Auslassschlauch, der mit einem Vakuumabfallbehälter verbunden ist, die Kammerlösung entfernt und ein Überlaufen verhindert.
   Anmerkung: Die E-Lösung enthält Tetraethylammonium (TEA⁺) und Cäsium (Cs⁺)-Ionen, um die K⁺-Ströme zu hemmen.
3. Bereiten Sie eine Arbeitsstofflösung von Amphotericin-B in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor (1 mg pro 10 μl DMSO). Um das Amphotericin-Pulver vollständig aufzulösen, beschallen (mindestens 15 min) und die Lösung gut vortexen.
   Anmerkung: Dieser Schritt dauert in der Regel weniger als 10 Minuten. Das Auflösen von 3–4 mg Amphotericin-B in 30–40 μl DSMO in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen funktioniert gut. Höhere Mengen an Amphotericin-B erfordern mehr DSMO-Lösungsmittel, was typischerweise zu einem längeren Intervall zum Mischen und einer unvollständigen Solubilisierung der im Röhrchen vorhandenen Amphotericin-B-Feststoffpartikel führt.
4. Die Stammlösung von Amphotericin-B wird in der Pipettenlösung (Lösung P, Tabelle 1) gelöst, um eine Endkonzentration von 200–500 μg/ml zu erhalten. Dieser Schritt erfordert eine umfangreiche Beschallung und Vortexierung bei hoher Geschwindigkeit (8–10/10) für ~30 bis 60 min pro Schritt, um eine optimale Durchmischung zu gewährleisten und die Bildung von Amphotericin-B-Fällung in der Pipettenlösung zu verhindern.
   Anmerkung: Amphotericin-B fällt mit der Zeit aus und ist lichtempfindlich. Die Arbeitspipettenlösung, die Amphotericin-B enthält, wird auf Löslichkeit geprüft, vor dem Befüllen der Pipette von Hand gemischt und im Dunkeln aufbewahrt.
5. Ziehen Sie an mehreren Patch-Elektroden, polieren Sie die Elektrodenspitzen und beschichten Sie die Spitzen (falls erforderlich) mit Zahnwachs.
6. Füllen Sie die Spitze einer Patch-Elektrode mit der Pipettenlösung (Lösung P, Tabelle 1) ohne Amphotericin-B, indem Sie die Elektrode kurz in die Lösung tauchen.
7. Füllen Sie die Elektrode mit der gleichen Pipettenlösung auf, die Amphotericin-B enthält.
8. Montieren Sie die Elektrode auf einer Halterung, die mit einem Patch-Clamp-Verstärker verbunden ist.
9. Platzieren Sie die Elektrode mit einem Mikromanipulator knapp unter der Oberfläche der extrazellulären Lösung, so dass die Spitze der Elektrode gerade untergetaucht ist.
10. Stellen Sie im Voltage-Clamp-Modus das Haltepotenzial auf 0 mV ein und stellen Sie den Strom mit dem Pipetten-Offset-Drehregler am handelsüblichen Verstärker auf 0 pA ein (Materialtabelle).
11. Bestimmen Sie den Elektrodenwiderstand mit dem Membrantest-Fenster/der Funktion der kommerziellen Erfassungssoftware (Materialtabelle). Um die Funktion zu aktivieren, klicken Sie auf Extras>Membrantest>Wiedergabe oder auf ein Verknüpfungssymbol in der Software. Der ermittelte Elektrodenwiderstand sollte im Bereich von 2 bis 5 MΩ liegen.
    Anmerkung: Die Membrantest-Funktion, die in der kommerziellen Erfassungssoftware oder der Seal-Test-Option am Verstärker bereitgestellt wird, kann zur Überwachung des Elektrodenwiderstands verwendet werden, indem Spannungsstufen wiederholt angelegt werden.
12. Fahren Sie mit der Überwachung des Elektrodenwiderstands fort, während Sie die Elektrode mit einem Mikromanipulator in Richtung einer ausgewählten DSM-Zelle schieben (Abbildung 1A).
    Anmerkung: Um als lebensfähige DSM-Zelle angesehen zu werden, muss die Zelle eine spindelförmige, längliche Morphologie, einen gut definierten Halo um die Zelle, scharfe Ränder und ein halbkontraktiles (serpentines) Aussehen aufweisen.
13. Wenn Sie die Zelloberfläche mit der Elektrode berühren – angezeigt durch einen schnellen Anstieg des Elektrodenwiderstands, der mit der Membrantestfunktion gemessen wird – bilden Sie eine Giga-Versiegelung, indem Sie über einen Schlauch einen sanften, schnellen Unterdruck auf den Elektrodenhalter ausüben. Dies führt zu einem Unterdruck, der an der Spitze der Elektrode erzeugt wird, der die Zellmembran in die Elektrode zieht, was zur Bildung einer Giga-Dichtung oder eines sehr engen Kontakts zwischen der Elektrode und der Plasmamembran beiträgt (Abbildung 1B).
14. Sobald sich die Giga-Dichtung gebildet hat, kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie die schnellen und langsamen Drehregler am kommerziellen Verstärker einstellen und die Stabilität der Giga-Dichtung (Leckstrom) mit der Membrantest-Funktion überwachen.
15. Lassen Sie Amphotericin-B Zeit, typischerweise 30–60 Minuten, um durch die Pipette zu diffundieren und in die Plasmamembran eingeführt zu werden, wodurch Poren gebildet werden, die hauptsächlich selektiv für monovalente Kationen sind. Fahren Sie während dieses Schritts mit der Überwachung der Giga-Dichtung mit der Membrantest-Funktion fort. Mit zunehmender Zellperforation steigt auch die Amplitude der Kapazitätstransienten (vergleiche Abbildung 1B mit Abbildung 1C ohne bzw. effektive Zellperforation), die mit der Membrantestfunktion gemessen wird.
16. Wenn die Patch-Perforation optimal ist (gemessen an einem stabilen Serienwiderstand, der typischerweise unter 50 MΩ liegt), heben Sie die Kapazitätstransienten auf, indem Sie die Drehregler für die Zellkapazität und den Serienwiderstand am Verstärker anpassen. Zu diesem Zeitpunkt kann auch eine Serienwiderstandskompensation durchgeführt werden (Abbildung 1D).
17. Sobald stabile spannungsstufeninduzierte Kationenströme beobachtet wurden, die durch das angegebene Protokoll hervorgerufen werden, wenden Sie eine Verbindung oder einen physiologischen Zustand an, um durch Superfusion zu testen, und zeichnen Sie die Reaktionen für die Kontroll-, Testbedingung und Auswaschung (falls möglich) mit der kommerziellen Erfassungssoftware auf.
    1. Zeichnen Sie Ströme mit einem routinemäßigen Spannungsschrittprotokoll auf, bei dem DSM-Zellen bei -64 oder -74 mV gehalten und die Spannung in 10-mV-Schritten für 400 oder 500 ms von -94 auf +96 oder +106 mV erhöht und zum Haltepotenzial zurückgekehrt wird.
       Anmerkung: Die Membranpotentialwerte sind für ein Flüssigkeitsübergangspotential von 14 mV angepasst (unter Verwendung von P- und E-Lösungen, Tabelle 1). Das Flüssigübergangspotential wird in der kommerziellen Erfassungssoftware (Table of Materials) ermittelt, indem Sie auf Tools>Junction Potentials klicken und die Konzentrationen der Lösungsionenkomponenten eingeben. Ein Rampenprotokoll kann auch verwendet werden, um aktuelle Aufzeichnungen zu erhalten.
    2. Führen Sie das Spannungsprotokoll während eines Experiments in einem kontinuierlichen Intervall von ~1 min aus, um Ströme für die Steuerung vor der Addition, die Testbedingungen und die Auswaschung aufzuzeichnen.

Art der Lösung	Zusammensetzung (in mM)
DS (Dissektions-/Aufschlusslösung)	80 Na-Glutamat, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 und 11 Glukose, pH-Wert eingestellt auf 7,4 (mit 10 M NaOH)
DS-P (Papain-haltiges DS)	DS mit 1–2 mg/ml Papain, 1 mg/ml Dithiothreitol und 1 mg/ml Rinderserumalbumin
DS-C (Kollagenase-haltiges DS)	DS-Lösung mit 1–2 mg/ml Kollagenase Typ II, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 0 oder 1 mg/ml Trypsininhibitor und 100-200 μM Ca2+
P (Pipette)	110 CsOH, 110 Asparaginsäure, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA und 30 CsCl, pH-Wert eingestellt auf 7,2 mit CsOH und ergänzt mit Amphotericin-B (300-500 μg/ml)
E (extrazellulär)	10 Tetraethylammoniumchlorid (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES und 10 Glukose, pH-Wert eingestellt auf 7,3–7,4 mit NaOH oder CsOH und 0,002–3 (2–3 mM) Nifedipin

Tabelle 1: Zusammensetzungen der Dissektions-/Verdauungslösung (DS) sowie der Pipette und der extrazellulären Lösungen, die in perforierten Patch-Clamp-Experimenten verwendet wurden.

Results

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schritte, die an der Bildung von Giga-Siegeln und der Amphotericin-B-Perforation von humanen DSM-Zellen beteiligt sind. Dargestellt sind die räumlichen Positionen einer Amphotericin-B-haltigen Pipette und einer DSM-Zelle zusammen mit den zugehörigen Reaktionen für Membrantests, die in der kommerziellen Erfassungssoftware (Table of ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml Tube aus Polystyrol mit rundem Boden	Falke	352054	Röhrchen für DS, die Enzyme enthalten, die in Verdauungsschritten verwendet werden
Amphotericin-B	Fischer	Nr. BP928-250	Wird für die Patch-/Zellperforation verwendet
Amphotericin-B	Referenzstandards des Europäischen Arzneibuchs	5	Wird für die Patch-/Zellperforation verwendet
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich	Nr. A9528-100MG	Wird für die Patch-/Zellperforation verwendet
Analoger Vortex-Mischer	VWR	Tel.: 58816-121
Asparaginsäure	Sigma-Aldrich	Nr. A9006	Intrazelluläre Pipettenlösung
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	Nr. A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	Nr. C1016	Extrazelluläre Lösung und DS
Kapillarglas	Sutter	BF150-110-7.5	Kapillare zur Präparation von gezogenen Patch-Elektroden
Cäsiumhydroxid-Hydrat	Sigma-Aldrich	Nr. C8518	Intrazelluläre Pipettenlösung
Die Software Clampex Version 10 umfasst Programme zur Datenerfassung (Clampex) und Analyse (Clampfit)	Axon Instrumente/ Molekulare Bauelemente	pCLAMP-10	Kommerzielle Software und Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Extrazelluläre und intrazelluläre Lösungen
Zahnwachs	Miltex Dental Wax Technologies, Inc.	18058351
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	Nr. D2650	Lösungsmittel
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	Nr. E3889	Ca2+-Chelator, wird in intrazellulärer Pipettenlösung verwendet
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher	Sutter	P-97	Erforderlich, um Elektroden mit sehr feinen Spitzen zu ziehen
Schwimmendes Schaumstoffrohrgestell/-halter	VWR Scientific	Artikel-Nr.: 82017-634	Wird zum Halten von Röhrchen mit Enzymen zur Temperaturkontrolle verwendet
Traubenzucker	Sigma	Nr. G8270
Glutaminsäure (Na-Salz)	Sigma-Aldrich	Nr. G1626	Ds
HEPES	Sigma-Aldrich	Nr. H3375	pH-Puffer
Kcl	Fisher Scientific	Nr. BP366-1	Extrazelluläre Lösung
Geräuscharmes Datenerfassungssystem	Axon Instrumente/ Molekulare Bauelemente	Digidata 1440A	Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups
Magnetrührer	VWR	Tel.: 01-442-684
MgCl2 (Hexahydrat)	Sigma-Aldrich	M2670	Extrazelluläre und intrazelluläre Lösungen
MikroSchmiede	Narishige	MF-830	Wird für Feuerpolierelektroden verwendet
NaCl	Sigma-Aldrich	Nr. S7653	Extrazelluläre und intrazelluläre Lösungen
NaOH	Sigma-Aldrich	Nr. S8045
Nifedipin	Sigma-Aldrich	Nr. N7634	spannungsgesteuerter Ca2+-Kanalblocker vom Typ L
Nikon Inverses Mikroskop, TS100 mit T1-SM-Tisch mit 5x-, 10x-, 20x- und 40x-Objektiven	Nikon	unterbrochen	Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups
Nichtmetallische Spritzennadel, MicroFil	WPI	MF-34G-5	Befüllen mit intrazellulärer Pipettenlösung
Pasteur-Pipette	FisherBrand	13-678-20A	Die Spitzen werden abgebrochen und feuerpoliert und für die Titration von enzymatisch behandelten Geweben verwendet, um einzelne DSM-Zellen aus Stücken zu befreien
Patch-Clamp-Verstärker	Axon Instrumente/ Molekulare Bauelemente	Axon Axopatch 200B	Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups
PC-Computer	Tal	Benutzerdefinierte Konfiguration	Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups
pH-Messgerät	Aspera Instrumente	PH700
Polyethylen-Schläuche	Intramedic (Englisch	Tel.: 427-436	Schlauch für die Superfusion des extrazellulären Bades, der mit der Aufzeichnungskammer mit Glasboden verbunden ist
Tetraethylammoniumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. T2265	Ionenkanalblocker aus Kv- und BK-Kanälen, der der extrazellulären Badlösung zugesetzt
Gewichtungsskala	Mettler Toledo	XS64
ZeissAxiovert 40C inverses Mikroskop mit 10x und 40x Objektiven	Carl-Zeiss	unterbrochen	Teil des Patch-Clamp-Rig-Setups