Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
HINWEIS: Unbehandelte, gesunde Wildtyp-Mäuse (WT) (n = 4) und cd44-/- (n = 4) Mäuse wurden im Alter von 12-16 Wochen getötet. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet. Alle Mäuse befanden sich auf dem C57Bl/6-Hintergrund.
>1. Nierendissektion bei Mäusen
- Opfern Sie gesunde WT-Mäuse oder genetisch veränderte Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation.
- Präparieren Sie ganze Mäusenieren direkt nach dem Opfern der Mäuse. Führen Sie dazu eine mediane Laparotomie mit einer Bauchschere durch, indem Sie die Haut und dann die Bauchmuskulatur durchtrennen. Entferne den Darm und lege ihn neben die Maus.
- Befreien Sie die Nieren vom Bindegewebe und ziehen Sie die Niere mit einer chirurgischen Zange heraus, indem Sie die Nierenarterie, die Nierenvene und den Harnleiter mit einer Schere durchtrennen.
- Entfernen Sie die Nierenkapseln aus den Nieren, indem Sie die Niere mit einer chirurgischen Zange festhalten und die Kapsel mit einer anderen Pinzette abziehen.
- Legen Sie die Nieren in eine 6-Well-Zellkulturplatte (2 Nieren/Well), die mit 2 ml Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) pro Well vorbereitet ist, und legen Sie sie auf Eis.
>2. Isolierung von Glomeruli aus der Mausniere
- Übertragen Sie die Nieren in eine 100 mm Petrischale und hacken Sie die Nieren mit zwei Skalpellen in kleine Stücke von 1-2 mm. Halten Sie die zerkleinerten Nierenstücke mit 1-2 ml HBSS feucht.
- Legen Sie die gehackten Nierenstücke auf ein 300 μm Metallsieb und drücken Sie die Niere mit einem Kolben einer 20 mL Spritze durch das Sieb. Spülen Sie das Sieb zwischendurch immer wieder mit HBSS aus und sammeln Sie den Durchfluss in einer sauberen Petrischale mit einer serologischen Pipette. Sammeln Sie auch alles, was an der Unterseite des Siebes übrig bleibt/klebt, indem Sie es mit dem Skalpell abkratzen und geben Sie es in den aufgefangenen Durchfluss (Nierenhomogenat).
- Spülen Sie das Nierenhomogenat durch ein 75-μm-Sieb mit HBSS. Sammeln Sie den Durchfluss und spülen Sie diesen anschließend durch ein 53 μm Sieb. Waschen Sie beide Siebe mit HBSS, um alle kleineren Strukturen zu entfernen.
Anmerkung: In diesem Schritt wird der Durchfluss nur gespült, aber nicht durch das 75 μm und 53 μm Sieb gepresst. Das Waschen mit HBSS ist notwendig, um Schmutz und kleinere Strukturen auf den Sieben zu entfernen. Daher werden in der Regel insgesamt 200-300 ml HBSS verwendet.
- Sammeln Sie die Nierenstrukturen/das Nierenmaterial, die auf dem 75 μm und 53 μm Sieb verbleiben, indem Sie die Oberseite der Siebe mit Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) waschen, das mit 20% fötalem Kälberserum (FCS) ergänzt wird, und das Material in eine 6-Well-Mikroplatte mit ultraniedriger Bindung übertragen.
Anmerkung: Um die Oberseite des Siebes zu waschen, spülen Sie das Sieb in einer gekippten Position (>45°) aus und sammeln Sie das Nierenmaterial am Siebrand. Das gesammelte Material ist sowohl für verkapselte als auch für entkapselte Glomeruli angereichert und zeigt nur wenige röhrenförmige Fragmente. Verkapselte Glomeruli sind sehr klebrig. Um einzelne Glomeruli zu sammeln, ist es daher wichtig zu verhindern, dass Glomeruli an der Oberfläche einer Petrischale oder einer Well-Platte haften. Um ein Anhaften zu vermeiden, verwenden Sie Medium mit 20 % FCS und verwenden Sie für diesen Schritt extrem niedrige Befestigungsplatten.
>3. Kultivierung des glomerulären Auswuchses
- Bringen Sie die Mikroplatte mit extrem niedrigem Attachment in ein inverses Lichtmikroskop und sammeln Sie einzelne verkapselte und/oder entkapselte Glomeruli mit einer 20-μl-Pipette. Vermeiden Sie das Pipettieren anderer Strukturen und Ablagerungen. Nachdem Sie einen einzelnen Glomerulus in der Pipettenspitze gesammelt haben, geben Sie frisches DMEM-Medium ohne angesammeltes Nierenmaterial in dieselbe Pipettenspitze bis zu einem Volumen von 20 μl.
- Den einzelnen Glomerulus mit dem 20 μl DMEM-Medium in die Mitte einer Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte überführen und 3 h bei 37 °C und 5 % (v/v) CO2 inkubieren, um die Befestigung des Glomerulus an der Mitte der Vertiefung zu ermöglichen. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um ein Aufschwimmen des Glomerulus an den Rand der Vertiefung zu vermeiden.
- Nach 3 h Inkubation wird der Glomerulus in der Mitte der Vertiefung befestigt. Geben Sie vorsichtig 500 μl endotheliales Basalmedium (EBM), ergänzt mit einem Wachstumsfaktor-Kit, das Hydrocortison, den humanen endothelialen Wachstumsfaktor, Rinderhirnextrakt und Gentamicinsulfat-Amphotericin B (Materialtabelle) und zusätzlich 5 % (v/v) FBS und 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptokokken) enthält, in jede Vertiefung
.
- Kultivieren Sie die einzelnen Glomeruli 6 Tage lang bei 37 °C, 5 % (v/v) CO2,
HINWEIS: Innerhalb von 6 Tagen bildet sich der Auswuchs aus parietalen Epithelzellen. Wenn man die Wirkung bestimmter Verbindungen oder Arzneimittel auf die Parietepithelzellen testen möchte, sollte es innerhalb dieses Zeitraums von 6 Tagen dem Medium zugesetzt werden.
