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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Implantieren des Tumors
HINWEIS: Jede Maus wird mit 1 x 105 MB49-PSA-Zellen in 50 μl DMEM-Blankmedium in die Blase implantiert. Bereiten Sie aufgrund des Totraums im Katheter immer zusätzliches Volumen vor (mindestens 100 μl extra pro Maus). Ein alternativer Ansatz wäre die Verwendung einer luftgefüllten Spritze.
- Zellen
- Einen Tag vor der Implantation, wenn die Zellen zu etwa 80 % konfluent sind, passieren Sie die MB49-PSA-Tumorzellen in vollständigem DMEM-Medium (ergänzt mit 10 % FBS, 2 mmol/l L-Glutamin, 0,05 mg/ml Penicillin-Streptomycin und 200 μg/ml Hygromycin B) bei 37 °C und 5 % CO2 bei einem Split-Verhältnis von 1:2.
- Ernten Sie die Zellen am Tag des Eingriffs, indem Sie sie vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber abkratzen. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und einer 0,4%igen Trypanblaulösung. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer. Nicht implantieren, wenn mehr als 20% der Zellen abgestorben sind.
- Berechnen Sie die Anzahl der benötigten lebenden Zellen (2 x 106 Zellen/ml) und übertragen Sie diese in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Bei 250 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in DMEM-Rohlingen. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal, um alle Spuren von FBS vor der Implantation zu entfernen.
- Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis die Mäuse für die Implantation bereit sind.
- Lassen Sie die 4 bis 6 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäuse sich eine Woche vor dem Eingriff akklimatisieren. Alle Tierarbeiten müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Wiegen Sie jede Maus und injizieren Sie eine Anästhesie (75 mg/kg Ketamin und 1 mg/kg Medetomidin) intraperitoneal in einer Menge von 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. Das Körpergewicht sollte zwischen 17 und 22 g liegen. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie nach einem Zehenklemmen keine Reaktion beobachten.
- Zur Identifizierung markieren Sie das Ohr mit einem Ohrlocher.
- Injizieren Sie Hartmanns Lösung oder Verbindung Natriumlactat intraperitoneal in einer Menge von 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht alle 1–2 h zur Flüssigkeitszufuhr.
- Tragen Sie eine sterile Augensalbe mit einem sterilen Wattezwiebel auf beide Augen auf, da der Blinzelreflex unter Narkose verloren geht und die Augen austrocknen. Bei Bedarf erneut auftragen.
- Legen Sie die Mäuse in Rückenlage auf Papiertücher auf eine Wärmepackung (aktiviert durch Kontakt mit Luft), um die Körpertemperatur zu halten, und kleben Sie die Hinterbeine fest.
- Üben Sie mit einem Finger sanften Druck auf die untere Bauchregion aus und sammeln Sie den Urin aus der Blase in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Probe dient als Basalwert des PSA im Urin.
- Ziehen Sie steriles Poly-L-Lysin (PLL) in eine 1-ml-Spritze und legen Sie einen 24-Gauge-IV-Katheter an, wobei das Nadelmandrin entfernt wird. Tragen Sie Gleitmittel auf die Spitze des Katheters auf und führen Sie den Katheter mit einer Pinzette durch die Harnröhre in die Blase ein, um die Katheterisierung zu leiten. Stoppen, wenn ein Widerstand zu spüren ist.
HINWEIS: Forscher sollten mit ihrem Veterinärpersonal über die Notwendigkeit der Verwendung eines Gleitgels mit Anästhetikum für intravesikale Instillationen und die Verwendung von Analgetika nach dem Eingriff sprechen.
- Instillieren Sie 50 μl PLL langsam, mit einer Rate von 10 μl alle 20 s, um vesikoureteralen Reflux zu vermeiden. Lassen Sie den Katheter 20 Minuten lang in der Blase mit einem Stopfen, um einen Abfluss zu verhindern.
- Entfernen Sie nach 20 Minuten den Katheter und befreien Sie die Blase von jeglichem Inhalt, indem Sie leicht auf die untere Bauchregion drücken. Spülen Sie mit einer leeren 1-ml-Spritze den restlichen Inhalt aus dem Katheter.
- Mischen Sie die MB49-PSA-Zellen gründlich durch Pipettieren und ziehen Sie sie in eine 1-ml-Spritze. Legen Sie den Katheter an und tragen Sie Gleitmittel auf. Träufeln Sie 50 μl von 1 x 105 Zellen mit einer langsamen Rate von 10 μl alle 20 s. Setzen Sie den Stopfen wieder auf den Katheter. Geben Sie Kontrollmäusen 50 μl Kochsalzlösung.
- Entfernen Sie nach 1 Stunde die Katheter und befreien Sie die Blase von jeglichem Inhalt. Entfernen Sie das Klebeband an den Hinterbeinen und legen Sie die Mäuse auf die Bauchseiten. Beleben Sie die Mäuse durch subkutane Injektion des Umkehrarzneimittels (1 mg/kg Atipamezol) in einer Menge von 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht.
- Überwachen Sie die Mäuse, bis die Motilität beobachtet wird. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück.