Herstellung von Krebs-Sphäroidblöcken durch Schockfrosten: Ein Verfahren zur Konservierung von Krebs-Sphäroiden in gefrorenen Matrixblöcken

Zusammenfassung

Quelle: Wang, Y. et al. 3-D Zellkultursystem zur Untersuchung der Invasion und Bewertung von Therapeutika bei Blasenkrebs. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Herstellung von Krebs-Sphäroidblöcken durch Kurzgefrieren, eine Technik, bei der eine Gewebeprobe von Interesse auf eine ultrakalte Temperatur eingefroren wird, wobei die Sphäroide in der Matrix zurückgehalten werden.

Protokoll

>1. Vorbereitung eines Probenblocks mit Krebs-Sphäroiden für die Schnitte von gefrorenem Gewebe

1. Heben Sie den Block aus Kollagengel und Sphäroiden vorsichtig mit einer kleinen Pinzette von den Objektträgern der Kammer. Legen Sie den Kollagen-Gel-Block in eine Histologie-Kunststoffform.
2. Spülen Sie das Kollagengel mit 1x PBS kurz aus und fixieren Sie es anschließend mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
   Anmerkung: PFA ist ein potentielles Karzinogen und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden.
3. Waschen Sie das Kollagengel mit 1,5 mL 1x PBS auf einem Shaker für 15 min. Tauschen Sie das PBS aus und wiederholen Sie den vorherigen Waschschritt 3x.
4. Tragen Sie eine dünne Schicht (ca. 3 mm) der optimalen Schnitttemperatur (OCT) auf, um den Boden einer neuen Histologieform aus Kunststoff zu bedecken. Legen Sie das fixierte und gewaschene Kollagengel auf die OCT-Verbindung und betten Sie dann das gesamte Gel vorsichtig ein, indem Sie die Form mit der OCT-Verbindung füllen, während Sie die Bildung von Luftblasen im OCT vermeiden.
5. Lassen Sie die Form 1 h lang bei 4 °C stehen.
6. Stellen Sie die Form mit der Probe und der OCT-Verbindung auf eine 100-mm-Petrischale, die auf flüssigem Stickstoff schwimmt. Lassen Sie die Probe vollständig schockgefrieren.
7. Lagern Sie den gefrorenen Probenblock für die zukünftige Verwendung bei -80 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM-Zellkulturmedium	Thermo Fisher Scientific	11995065
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A3803
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Kollagen Typ 1 aus Rattenschwanz, high Konzentration	Corning	354249
Nunc Lab-Tek II Kammer Deckglas	Thermo Fisher Scientific	155382
Paraformaldehyd-Lösung	Elektronenmikroskopie	Artikel-Nr.: 15710
O.C.T.-Mischung	Thermo Fisher Scientific	23730571