Abgabe von DNA-Plasmiden in das Urothel der Mausblase: Ein auf Elektroporation basierendes Verfahren zur effizienten Verabreichung von DNA-Plasmiden in Urothelzellen der Mausblase zur Generierung gentechnisch veränderter Modelle

Zusammenfassung

Quelle: Chuan, Y. et al. Neuartige Methode zur Abgabe von Plasmid-DNA an das Urothel der Mausblase durch Elektroporation. J. Vis. Exp.(2018)

Dieses Video zeigt die Abgabe von DNA-Plasmid in das Urothel der Mausblase mit einer Kombination aus Harnröhrenkatheterisierung und Elektroporationstechniken. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Generierung von Maus-Blasenkrebsmodellen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung von Plasmiden und Werkzeugen

1. Für jede zu transfizierende Blase werden mindestens 20 μl DNA-Plasmid (1 μg/μl) vorbereitet.
2. Geben Sie 1 μl Trypanblau zu den 20 μl Plasmidlösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipetten, um es gut zu vermischen.
3. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Besprühen Sie chirurgische Instrumente und Handschuhe häufig mit 70 % Ethanol oder verwenden Sie einen Glasperlensterilisator, wenn Sie die folgenden Schritte ausführen, um sterile Bedingungen zu erhalten.

>2. Abgabe von Plasmiden

1. Tragen Sie 70% Ethanol auf den betäubten Mäusebauch auf und machen Sie mit einem Skalpell einen vertikalen Schnitt von 1 cm, um die Bauchhaut über der Blase zu öffnen.
2. Pipettieren Sie mindestens 20 μl Plasmid plus Trypanblau-Lösung in das äußere Ende des Katheters und befestigen Sie die Spritze.
3. Injizieren Sie die Plasmidlösung in die Blase. Färbt sich die Blase blau, ist die Injektion erfolgreich. Lassen Sie etwas Flüssigkeit im Katheter, um Luftblasen in der Blase zu vermeiden.
4. Fassen Sie die äußere Harnröhrenöffnung mit einer Pinzette an und entfernen Sie dann den Katheter und die Spritze. Verwenden Sie eine Schnur, um die äußere Harnröhrenöffnung zu straffen. Mit der Schnur zwei Schlaufen machen und dann mit zwei Knoten binden.
   Anmerkung: Die Straffung der Harnröhre ist wichtig, um einen Rückfluss von Plasmidflüssigkeit zu verhindern.
5. Schalten Sie den Elektroporationsgenerator mit den folgenden Parametern ein: 33 V, 50 ms Arbeitszeit und 950 ms Intervallzeit.
6. Halten Sie die Blase mit einer Pinzette fest und kneifen Sie die Blase mit zwei Elektroden zusammen. Drücken Sie das Fußpedal, um die Elektroporation durchzuführen.
   Anmerkung: Die elektrischen Impulse sind so eingestellt, dass sie 5 Mal mit kurzen Intervallen nach jedem Pedaltritt auftreten. Die Maus kann dabei zucken. Wenn Sie das Fußpedal mehr als einmal betätigen, kann dies die Effizienz der Abgabe erhöhen, aber zu viele elektrische Impulse können die Gewebeintegrität des Urothels schädigen.
   1. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt zwischen der Pinzette und den Elektroden, da dies einen Funken erzeugt.

>3. Wiederherstellung

1. Vernähen Sie die Bauch- und Hautöffnung mit sterilen chirurgischen Nähten und Clips. Tragen Sie Jod auf die Wunde auf.
2. Entfernen Sie das Tier aus dem Isofluran-System. Verabreichen Sie Buprenorphin Analgetikum (0,1 mg/kg) subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern.
3. Bewahren Sie das Tier auf dem Heizkissen auf und bringen Sie es nach vollständiger Genesung in den Heimkäfig zurück. Kontrollieren Sie das Tier mindestens einmal täglich auf normale Mobilität, Trink- und Fütterungsverhalten und auf keine Anzeichen einer Infektion, bis der Schnitt verheilt ist, und entfernen Sie dann die Klammern. Verabreichen Sie nachfolgende Injektionen von Buprenorphin-Analgetikum, wenn das Tier Schmerzsymptome wie verminderte Fellpflege, erhöhte Aggressivität und Lautäußerung zeigt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD 1mL TB Spritze	Fischer	148232E
Buprenorphin	Sigma	B9275-50MG
Dumont Pinzette	Roboz Chirurgische Instr	RS-5005	Vor der chirurgischen Anwendung mit 70% Ethanol behandeln
ECM830 SQ Wave Elektroporator	Harvard-Apparatur	450052
Exel International Einweg-Safelet IV-Katheter	Fisher Scientific	Tel.: 14-841-21	24G, 2.11 cm Länge, 0.045 cm Außendurchmesser
Extra feine Mikro-Präparierschere	Roboz Chirurgische Instr	RS-5135	Vor der chirurgischen Anwendung mit 70% Ethanol behandeln
Isofluran	Tierarzt eins	501017
K&H beheizte Ruhematte für Kleintiere, 9 x 12 Zoll	Amazonas		Decken Sie die Heizmatte mit Küchenpapier ab
Augensalbe	Fischer	NC0849514
PBS, pH 7,4	Lebenstechnologien	10010049
Pipettenspitzen 200 μL	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1111-0206
Pipettenspitzen, universelle Passform; 0,1 bis 10 μl	Fischer	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
Plasmid CAG-GFP	Addgene	Artikel-Nr.: 16664
Platin-Pinzette 5 mm	Harvard-Apparatur	450489	5 mm Durchmesser
Schere	Roboz Chirurgische Instr	RS-5880	Vor der chirurgischen Anwendung mit 70% Ethanol behandeln
Schnur	Amazonas		Mandala Crafts 150D 210D 0,8 mm 1 mm Leder Nähnähte flach gewachste Faden Schnur
Klebeband, Scotch	Fischer	19047257
Therio-gel Veterinär-Gleitmittel	PBS Tiergesundheit	Nr. 353-736
Trypan Blauer Fleck	Lebenstechnologien	15250061
V-1 Tischsystem-Anästhesie	VetEquip	901806
Vicryl violettes Nahtmaterial 18" FS-2 Schneiden 5-0	Fischer	NC0578475
Walgreens Povidon Jod 10%	Walgreens	953982
Gewickelter Clip	Fischer	Nr. 18045
Aufbringer für gewickelte Clips	Fischer	Nr. 1804