Exosomenisolierung: Eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik, bei der Saccharosekissen verwendet werden, um Exosomen von konditionierten Medien kultivierter Zellen zu trennen

Zusammenfassung

Quelle: Faruqu, F. N. et al. Vorbereitung von Exosomen für die siRNA-Verabreichung an Krebszellen.J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik zur Isolierung von Exosomen aus konditionierten Medien, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellkulturen unter Verwendung eines in Deuteriumoxid hergestellten 25% (w/w) Saccharosekissens gewonnen wurden. Die isolierten Exosomen können für Downstream-Anwendungen eingesetzt werden.

Protokoll

>1. Isolierung von Exosomen auf einem Saccharosekissen

1. Das geerntete konditionierte Medium (CM) wird wie folgt durch Differenzzentrifugation und Filtration vorgereinigt.
   Bei
   1. 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und das Pellet entsorgen. Dieser Zentrifugationsschritt wird noch einmal wiederholt, wobei der Überstand zurückgewonnen und das Pellet verworfen wird.
   2. Den Überstand aus Schritt 1.1 bei 2.000 x g für 15 min und 4 °C zentrifugieren und anschließend das Granulat verwerfen. Der zurückgewonnene Überstand wird einmal durch 0,22 μm Filter filtriert.
2. Während der Vorreinigung wird eine 25%ige Saccharoselösung in Deuteriumoxid hergestellt, indem 1,9 g (± 0,001 g) Saccharose in einem Universalröhrchen genau abgewogen und dann mit Deuteriumoxid aufgefüllt wird, bis das Gewicht 7,6 g (± 0,001 g) erreicht.
3. Füllen Sie ein Ultrazentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) mit 22,5 mL vorgeklärtem CM. Füllen Sie das CM auf 22,5 mL mit 0,22 μm gefiltertem PBS, wenn das aktuelle Volumen kleiner ist.
4. Legen Sie eine Glaspipette (siehe Materialtabelle) in das Röhrchen und fügen Sie 3 ml Saccharoselösung hinzu, so dass die Lösung eine separate Schicht unter dem CM bildet.
5. Legen Sie das Röhrchen mit der geschichteten CM/Saccharoselösung vorsichtig in den Eimer eines Ausschwingrotors (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie den Eimer im Rotor.
6. Setzen Sie den Rotor in die Ultrazentrifuge ein (siehe Materialtabelle) und drehen Sie ihn 1,5 h lang bei 4 °C bei 100.000 x g.
7. Sammeln Sie 2 mL der Saccharoseschicht und geben Sie diese in eine Ultrazentrifugenflasche (siehe Materialtabelle) mit 20 mL gefiltertem PBS für einen Waschschritt.
8. Legen Sie die Röhrchen in einen Rotor mit festem Winkel (siehe Materialtabelle) und drehen Sie sie 1,5 h lang bei 4 °C bei 100.000 x g.
9. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer serologischen 10-ml-Pipette und resuspendieren Sie das Pellet mit 400 μl filtriertem PBS. Bewahren Sie diesen Exosomenvorrat für die Kurzzeit- bzw. Langzeitlagerung bei 4 °C bzw. -80 °C auf.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Saccharose	Fisher Scientific	Nr. S/8600/60	ca. 1 kg
Deuteriumoxid (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	ca. 250 g
1X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher Scientific	10010015	500 ml
Millex-GP Spritzenvorsatz-Filtereinheit 0,22 μm	Millipore	SLGP033RS
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-80
Ausschwingrotor	Beckman Coulter	SW45 Ti
Rotor mit festem Winkel	Beckman Coulter	Typ 70 Ti
Ultrazentrifugen-Röhrchen	Beckman Coulter	355631	Polycarbonat. Max. Füllung 32 ml
Ultrazentrifugen-Flaschen	Beckman Coulter	355618	Polycarbonat. Min. Füllung 16 ml, max. Füllung 25 ml
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
Glaspipetten	Fisher Scientific	Tel.: 1156-6963
25% w/w Saccharosekissen			1,9 g (± 0,001 g) Saccharose in eine Universaltube geben und mit D2O auffüllen, bis das Gewicht 7,6 g (± 0,001 g) erreicht. Das macht ~6ml des 25% w/w Saccharosekissens.