siRNA-Verkapselung in Exosomen mittels Elektroporation: Eine auf elektrischen Impulsen basierende Technik zum Laden von siRNA in Exosomen

Zusammenfassung

Quelle: Faruqu, F. N. et al. Vorbereitung von Exosomen für die siRNA-Verabreichung an Krebszellen. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt eine auf Elektroporation basierende Methode zur Verkapselung von siRNA in Exosomen. Die siRNA-beladenen Exosomen können dann für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.

Protokoll

>1. siRNA-Verkapselung in Exosomen durch Elektroporation

1. Kühle die Elektroporationsküvette (siehe Materialtabelle) vor der Elektroporation 30 Minuten lang auf Eis vor.
2. Mischen Sie 7,0 μg Exosomen (32 μl aus 7 x 10¹² p/mL Stamm in PBS) mit 0,33 μg siRNA (12 μl aus 2 μM Stamm in RNase-freiem Wasser) im Mikrozentrifugenröhrchen. Das Volumen wird mit Zitronensäurepuffer auf 150 μl aufgefüllt (siehe Materialtabelle). Das molare Verhältnis von Exosom zu siRNA beträgt in diesem Fall 1:60.
3. Übertragen Sie die Mischung in eine Elektroporationsküvette. Verschließen Sie die Küvette und setzen Sie sie in den Küvettenhalter des Elektroporators ein (siehe Materialtabelle). Drehen Sie das Drehrad um 180° im Uhrzeigersinn.
   Anmerkung: Das Rad muss vollständig in die verriegelte Position gedreht werden, damit die Küvette die Elektroden berühren kann.
4. Wählen Sie das gewünschte Elektroporationsprogramm (z.B. X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) und starten Sie die Elektroporation durch Drücken der Starttaste.
   Anmerkung: Ein erfolgreicher Impuls wird durch die Anzeige von "OK" auf dem Display angezeigt.
5. Entfernen Sie die Küvette nach der Elektroporation, nachdem Sie das Rad um 180° gegen den Uhrzeigersinn gedreht haben. Entnehmen Sie die Probe mit der Kunststoffpipette aus der Küvette zur weiteren Verarbeitung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Atto655-siRNA	Eurogentec	SQ-SIRNA	(gekennzeichnet-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55; (Ohne Beschriftung) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
Glaspipetten	Fisher Scientific	Tel.: 1156-6963
Amaxa Nukleofektor I	Lonza	Nukleofektor I	Mit den Nukleofector-Kits von Amaxa
Zitronensäurepuffer mit EDTA			0,1954 g Zitronensäure und 0,2087 g Dinatriumphosphat in 50 ml entionisiertem Wasser mischen. Fügen Sie EDTA zu 0,1 mM hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,4 ein.
Mikrofuge-Röhrchen	Starlab (Englisch)	Nr. S1615-5500	1,5 ml