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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Gewebeverarbeitung und Isolierung primärer tubulärer Zellen
- Entfernen Sie die Nierenkapseln und das Mark, hacken Sie beide Nieren in winzige Stücke und inkubieren Sie sie in 10 ml eines Verdauungspuffers in einem 37 °C Ofen mit sanfter Rotation für 5 Minuten.
- Entfernen Sie unverdautes Nierengewebe, indem Sie den Puffer durch einen 70-μm-Filter leiten. Fügen Sie 10 ml Nährmedium hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
- Um röhrenförmige Zellen zu sammeln, zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension bei 50 x g für 5 min, um das erste Pellet zu sammeln. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und fügen Sie 5 ml Kulturmedium hinzu, zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 50 x g, um sicherzustellen, dass alle röhrenförmigen Zellen im zweiten Pellet gesammelt werden. Die Zentrifugation erfolgt mit einer niedrigeren Drehzahl, um hauptsächlich schwere Tubuli zu pelletieren. Später, nachdem sich die Zellen von der Isolierung erholt haben, wird die reine röhrenförmige Kultur während der Subkulturen mit einer höheren Geschwindigkeit zentrifugiert.
- Das erste Pellet wird in 20 ml Nährmedium resuspendiert und 5 Minuten lang bei 50 x g zentrifugiert, um das dritte Pellet zu sammeln.
- Das zweite und dritte Pellet werden in 1 ml Nährmedium resuspendiert. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau, laden Sie die Mischung in Kammer A eines Zählobjektträgers und erfassen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem automatischen Zellzähler.
- Bis zu 107 Zellen (eine heterogene Population) auf eine einzelne 60-mm-Schale, die mit Kollagen vorbeschichtet ist, aussäen und die röhrenförmigen Zellen über Nacht anheften lassen.