Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Führen Sie die hydrodynamische Injektion des Nierenbeckens durch
- Wählen Sie Mäuse für die Operation sorgfältig aus.
HINWEIS: Stammspezifische Unterschiede wurden bisher nicht beobachtet, können aber möglich sein. Die meisten Injektionen erfolgten auf dem Hintergrund C57BL/6 oder FVB. Nierenbeckeninjektionen funktionieren am besten bei Mäusen, die 6–12 Wochen alt sind. Bei Mäusen, die länger als 16 Wochen alt sind, ist aus unklaren Gründen eine Misserfolgsrate von bis zu 50% durch Luziferase-Bildgebung möglich. Die gleiche altersbedingte Misserfolgsrate wurde bei hydrodynamischen Schwanzveneninjektionen in die Leber beobachtet, so dass dies eine allgemeine Einschränkung in Bezug auf das Prinzip der hydrodynamischen Injektion sein kann. In gleicher Weise haben andere gezeigt, dass die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in die fibrotische Rattenleber nicht so wirksam ist wie die einer gesunden Leber, so dass es möglich sein kann, dass bei Nierenfibrose die hydrodynamische Injektion des Nierenbeckens nicht so wirksam ist, aber dies wurde nicht direkt getestet.
>2. Bereiten Sie Mäuse und DNA-Spritzen für die Operation vor
- Betäuben Sie die Mäuse mit Ketamin und Xylazin.
- Ziehen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung an, die von der Tiereinrichtung verlangt wird, wie z. B. Einweg-Laborschürze, chirurgische Gesichtsmaske und Nitrilhandschuhe.
- Wenn Sie mit 2 bis 4 Mäusen gleichzeitig arbeiten, wiegen Sie jede Maus in einem 500-ml-Kunststoffbecherglas auf einer Waage, die auf 0,1 g genau ist. Berechnen Sie die korrekte Menge von 24 mg/ml Ketamin und 2 mg/ml Xylazin, verdünnt in normaler 0,9%iger Kochsalzlösung, die jeder Maus durch intraperitoneale Injektion verabreicht wird (siehe referenziertes Video für weitere Informationen zur intraperitonealen Injektion). Verwenden Sie die Formel (50 μL + ((5 μL) x (Gewicht(g))) oder berechnen Sie alternativ nach Absprache mit dem örtlichen Tierarztteam und der IACUC nach einer anderen Formel.
- Injizieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion mit Standardtechniken. Legen Sie die Maus in einen Papiereimer, bis die Maus unbeweglich ist.
HINWEIS: Mäuse sind bereit für die Operation, wenn sie nicht mehr auf den Zehenkneiftest ansprechen. Geben Sie Mäusen, die 20–30 Minuten nach der ersten Injektion weiterhin auf den Zehenkneiftest ansprechen, je nach Stärke der Reaktion 20–60 μl mehr Anästhetika.
- Legen Sie die Maus auf ein wasserumgewälztes Wärmekissen, das mit einem blauen Pad bedeckt ist, und geben Sie Tierarztsalbe in beide Augen, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Rasieren Sie die linke Seite des Rückens der Maus von der Schulter bis zum Hinterteil und von der Flanke bis zur Wirbelsäule mit einem Rasierer, der für die Pflege von Haustieren entwickelt wurde. Entfernen Sie lose Haare und Ablagerungen.
- Bereiten Sie für jede anästhesierte Maus eine separate Spritze mit 100 μl verdünnter DNA vor und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
- Verwenden Sie eine sterile 29G x 1/2" 0,5 mL U-100 Insulinspritze mit einer dauerhaft befestigten Nadel ohne Sicherung.
HINWEIS: Der Spritzentyp ist von entscheidender Bedeutung. Dieses Manometer ermöglicht eine schnelle Injektion. Die fest angebrachte Nadel verhindert das Auslaufen der Lösung. Das Vorhandensein von Sicherheit erschwert den Zugang zum Nierenbecken. Die in der Materialtabelle angegebenen Spritzen gleiten bei der Injektion gleichmäßiger als andere getestete Marken.
- Laden Sie die Spritze auf ~120 μl und ziehen Sie den Kolben nach unten, um oben einen Platz zu schaffen. Klopfen Sie mit einem Stift, bis alle Luftblasen nach oben steigen. Halten Sie die Nadel hoch und drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um die gesamte Luft zu entfernen, bis sich an der Spitze der Nadel ein Tröpfchen bildet. Es sollten keine sichtbaren Blasen vorhanden sein, da diese eine Luftembolie verursachen können, die das Tier tötet.
- Beenden Sie das Drücken des Kolbens, bis sich 100 μl in der Spritze befinden, indem Sie überschüssige DNA-Lösung in das ursprüngliche Mikrofuge-Röhrchen entleeren. Etikettieren Sie die geladenen Spritzen erforderlichenfalls sorgfältig und legen Sie sie auf ein steriles Tuch, um die Sterilität zu gewährleisten, wenn die Einrichtung, in der die Arbeiten durchgeführt werden, das Wiederverschließen der Nadeln nicht zulässt.
>3. Injektionsoperation durchführen
- Bereiten Sie die Stelle für die Operation vor. Legen Sie ein steriles Abdecktuch über das Wärmekissen und leeren Sie die sterilen chirurgischen Instrumente auf das sterile Abdecktuch, ohne sie zu berühren. Nehmen Sie die Maus und platzieren Sie sie im Sichtfeld. Passen Sie die Beleuchtung an, um den Bereich zu beleuchten.
- Nehmen Sie drei antiseptische Tupfer mit 3,15 % Chlorhexidingluconat und 70 % Isopropylalkohol aus den Packungen und legen Sie sie in die Nähe des Tieres.
- Ziehen Sie sterile OP-Handschuhe an. Arbeiten Sie in kreisenden Bewegungen, beginnend an der Inzisionsstelle, und tupfen Sie das Tier dreimal mit einem neuen Chlorhexidin/Alkohol-Tupfer ab.
- Lokalisieren Sie die Inzisionsstelle, wie in Abbildung 1A gezeigt. Kneifen Sie die Haut mit einer Pinzette zusammen und machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in die Hautschicht etwa 1 cm von der Wirbelsäule entfernt und unterhalb des Brustkorbs. Sobald die Schnittstelle etwa 1 cm lang ist, machen Sie eine ähnliche Schnittstelle unten in der Muskelschicht.
HINWEIS: Machen Sie den Schnitt auf die richtige Länge, damit die Niere gerade noch durch den Schnitt kommt und dann durch den Schnitt selbst an Ort und Stelle gehalten wird. Ein zu kleiner Schnitt und die Niere kann nicht freigelegt werden; Zu groß und die Niere rutscht immer wieder in die Bauchhöhle zurück.
- Lokalisieren Sie die Niere.
Anmerkung: Es kann im weißen Fettgewebe sichtbar sein. Die Milz befindet sich ebenfalls auf der linken Seite des Tieres. Die Farbe dieser Organe kann visuell unterschieden werden, da die Milz dunkelkastanienbraun ist, während die Niere dunkelrot-orange ist. Es ist nicht wünschenswert, die Milz zu manipulieren, da sie leicht reißen kann.
- Ohne die Niere zu berühren, legen Sie sie sanft aus der Bauchhöhle frei, indem Sie mit den Fingern gleichmäßigen, sanften Druck auf den Bauch ausüben (Abbildung 2C). Schieben Sie mit einer geschlossenen Pinzette unerwünschte Organe bei Bedarf vorsichtig in den Bauch zurück. Verwenden Sie keine offene Pinzette, da dies die Niere oder andere Organe schädigen kann.
- Sobald die Niere aus dem Bauch heraus ist, trennen Sie sie vorsichtig vom umgebenden Fett, gerade so weit, dass das Nierenbecken, ein kleiner weißer Punkt, sichtbar ist (Abbildung 1B). Überschüssiges Fett zur Seite schieben oder bei Bedarf entfernen. Achten Sie darauf, die Nebenniere, die sich in der Nähe des oberen Pols der Niere befindet, oder die Nierenkapsel nicht zu entfernen.
- Greifen Sie mit einer geschlossenen Pinzette die rechte Seite der Niere nach unten, so dass das Nierenbecken sichtbar bleibt, fassen Sie die geladene Insulinspritze mit der rechten Hand und halten Sie sie parallel zur Arbeitsfläche, wobei die Nadel auf das Nierenbecken gerichtet ist (Abbildung 2E). Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Nierenbecken der immobilisierten Niere ein, wie in Abbildung 1B gezeigt.
- Injizieren Sie die Lösung schnell innerhalb von drei Sekunden. Etwa ein Drittel der Niere kann sich klären und sich weiß verfärben.
HINWEIS: Es ist üblich, nach der Injektion eine Flüssigkeitsansammlung in der Nierenkapsel sowie die Bildung eines Hämatoms zu beobachten. Eine gewisse Schädigung ist notwendig, um ein ausreichendes Maß an DNA-Transfektion für den Nachweis zu erreichen.
- Halten Sie die Nadel ca. 10 s lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der Lösung zu verhindern. Entfernen Sie dann vorsichtig und langsam die Nadel. Bringen Sie das Organ wieder in die Bauchhöhle zurück, indem Sie die Inzisionsstelle vorsichtig dehnen und eine geschlossene Pinzette verwenden.
- Vernähen Sie die Muskelschicht des Tieres mit 5-0 resorbierbaren Nähten und setzen Sie 2-4 unabhängige Knoten.
- Vernähen Sie die Hautschicht des Tieres mit 5-0 oder 6-0 nicht resorbierbaren Nylonnähten und setzen Sie 2-4 unabhängige Knoten.
HINWEIS: Chirurgische Instrumente können wiederverwendet werden, nachdem sie in ein steriles Perlenbad gelegt und abgekühlt wurden.
