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>1. Implantation von Zellen
Um Renca-Zellen intrarenal zu implantieren, bereiten Sie Renca-Zellen in einer Einzelzellsuspension bei 2 x 106 Zellen/ml in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) vor.
- Adhärente Renca-Zellen aus dem Gewebekulturkolben mit 0,25 % Trypsin in HBSS entfernen. Nach ~5 Minuten geben Sie vollständiges RPMI in den Kolben, um das Trypsin zu neutralisieren, und überführen Sie die Zellen zum Waschen in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 relativer Zentrifugalkraft g (rcf x g) für 5 min bei 25 °C.
- Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in HBSS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie das Volumen mit HBSS an, um 2 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
- Ziehen Sie die Zellen in eine 1-ml-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um eine Scherbelastung der Zellen zu vermeiden. Ersetzen Sie die 18-Gauge-Nadel durch eine 28-Gauge-Nadel, bevor Sie die Tumorzellen injizieren. Eine Injektion von 0,1 mL gibt 2 x 105 Zellen in die Niere ab.
>2. Vorbereitung des Operationsbereichs
- Bereiten Sie einen sterilen Operationsbereich in einer Biosicherheitswerkbank vor, indem Sie ein steriles OP-Abdecktuch über ein Heizkissen legen. Sammeln Sie alle Vorräte, einschließlich Pinzette, Skalpell, Schere, Augentropfen, 5% Povidon-Jod-Antiseptikum und sterile Gaze. Autoklavieren Sie alle Instrumente vor dem Gebrauch.
- Führen Sie die Operation mit einer aseptischen Spitzentechnik durch. Resterilisieren Sie Instrumente zwischen Tieren mit einem Perlsterilisator. Tragen Sie sterile Handschuhe, einen Laborkittel und eine Gesichtsmaske.
>3. Vorbereitung von Tieren
- Betäuben Sie die Mäuse mit Ketamin/Xylazin (87,5 mg/kg bzw. 12,5 mg/kg, i.p.) gemäß den institutionellen Richtlinien. Bestimmen Sie die Narkosetiefe, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen.
- Wenn das Tier als nicht ansprechbar gilt, bereiten Sie die Injektionsstelle (z. B. linke Flanke) bei Balb/c-Mäusen vor, indem Sie das Fell zupfen (mit den Fingern) oder rasieren (mit einer Schermaschine).
- Bringen Sie die Mäuse aus dem Operationsvorbereitungsbereich (z. B. dem Haltungskäfig) in den Operationsbereich und tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Tupfen Sie die vorbereitete Inzisionsstelle großzügig mit 5% Povidon-Jod-Antiseptikum ab.
- Injizieren Sie Bupivacainhydrochlorid (0,1 ml einer 2,5 mg/ml-Lösung, s.c.) in den Bereich, in dem der Schnitt als präoperative Analgesie vorgenommen wird.
- Machen Sie einen einzelnen Schnitt (~1,0 bis 1,5 cm) an der linken Flanke des Tieres mit einem sterilen Skalpell oder einer Schere vorsichtig, um nicht in das Bauchfell einzudringen. Trennen Sie die Dermis mit einer sterilen Schere vom Bauchfell. Tupfen Sie die Inzisionsstelle mit steriler Baumwollgaze ab, um jegliches Blut zu entfernen.
- Halten Sie die Maus mit beiden Händen, wobei Sie mit der linken Hand den Kopf und mit der rechten Hand die Flanke stützen.
- Identifizieren Sie die Milz durch das Bauchfell und tasten Sie die Maus mit einem Finger der rechten Hand von unten ab, die Niere sollte nun durch das Bauchfell sichtbar sein. Halten Sie das Tier fest, um Spannung über das Bauchfell und die Niere zu erzeugen.
- Lassen Sie eine zweite Person die Tumorzellen (vorbereitet in Abschnitt 1.2) durch das intakte Peritoneum in die Mitte der Niere injizieren, wobei Sie eine 1-ml-Spritze verwenden, die mit einer 28-Gauge-Nadel versehen ist. Geben Sie langsam 0,1 ml (2 x 105) Zellen ab. Sobald die Zellen injiziert sind, halten Sie die Nadel 5–10 s lang an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Zellen zu reduzieren. Es ist wichtig, bei diesem Schritt äußerste Vorsicht walten zu lassen, da die Person, die die Zellen injiziert, die Nadel in die Nähe der Finger der Person bringt, die die Maus hält.
- Entfernen Sie die Nadel und verschließen Sie den Schnitt mit einer dünnen Schicht Cyanacrylat-Gewebekleber.
- Setzen Sie das Tier mit einem sterilen Papiertuch wieder in einen sauberen Käfig. Lassen Sie die Tiere sich auf einem Heizkissen erholen. Lassen Sie die Tiere während der Erholungsphase nicht unbeaufsichtigt. Bringen Sie die Tiere erst dann in die normalen Haltungsbedingungen zurück, wenn sie aufrecht und sternal sind. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien bei allen Verfahren mit Labortieren.