Reverse-Phase-Protein-Arrays-basierte Proteinexpressionsanalyse: Ein Verfahren zur gleichzeitigen Quantifizierung der Expression mehrerer Proteine aus Zelllysat

Abstract

Quelle: O'Mahony, F. C. et al. Die Verwendung von Reverse-Phase-Protein-Arrays (RPPA) zur Erforschung der Proteinexpressionsvariation bei einzelnen Nierenzellkrebsarten. J. Vis. (2013)

Dieses Video zeigt die Methodik zur Durchführung von Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) zur Untersuchung von Proteinexpressionsmustern aus Zelllysat. In RPPA wird das Lysat, das eine Mischung von Proteinen enthält, auf Nitrozellulose-Objektträger gedruckt und Proteine von Interesse werden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern analysiert.

Protocol

>1. RPPA-Druck

1. Proteinlysate wurden mit Hilfe eines MicroGrid II Roboter-Spotters auf Nitrozellulose-beschichtete Objektträger (Fastslides-Whatman) aufgespürt. Die verwendeten Objektträger enthielten 2 Pads, auf denen die Proben aufgefleckt wurden. Jedes Pad wurde mit identischen Proben gesichtet, in diesem Fall 100 Proben. Weitere verfügbare Formate sind 1-, 8- und 16-Block-Folien. Je höher die Anzahl der Pads, desto geringer ist die Anzahl der Proben, die auf jedem Pad entdeckt werden können.
2. Von jeder Probe wurde eine Reihe von fünf 2-fachen Verdünnungen vorgenommen, die dann in dreifacher Ausfertigung gespottet wurden (was insgesamt 15 Flecken pro Probe ergibt).

>2. Nachweis von RPPA-Proteinen

1. Nasse Objektträger in überschüssigem LiCor Blocking Buffer (50:50 verdünnt in PBS). Inkubieren Sie bei RT für 1 Stunde auf einer schaukelnden Plattform.
2. Bereiten Sie 800 μl Primärantikörper in LiCor Blocking Buffer (50:50 verdünnt in PBS) in den gewünschten Konzentrationen vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.
3. Montieren Sie die Objektträger entweder (i) in den Einzelrahmen-Chipclip oder (ii) den "FastFrame"-Objektträgerhalter mit vier Schächten, so dass eine dichte Abdichtung zwischen dem Objektträger und der Inkubationskammer entsteht.
4. Entfernen Sie den Restpuffer aus den Wells und geben Sie 600 μl Primärantikörper in die entsprechenden Wells.
5. Schieben Sie den Objektträger und die Kammer in eine verschlossene Nassbox und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C auf einer Schaukelplattform.
6. Besteht aus 0,1 % PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL PBS).
7. Entnehmen Sie die Objektträger aus dem Kühlraum und entfernen Sie vorsichtig die primären Antikörper aus jeder Vertiefung.
8. Fügen Sie 600 μl PBS-T hinzu und waschen Sie die Objektträger auf einer Schaukelplattform bei RT für 5 min (X3).
9. Bereiten Sie fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper vor, indem Sie zunächst 0,01 % SDS in Odyssey Blocking Buffer (50:50 verdünnt in PBS) bei einer Verdünnung von 1:2.000 (1 μL/2 ml) verdünnen.
10. Entfernen Sie den Puffer aus den Wells und geben Sie 600 μl fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper in die entsprechenden Wells. Inkubieren Sie Sekundärantikörper 45 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln; Es ist wichtig, die Membran bis zum endgültigen Scannen vor Licht zu schützen.
11. Nehmen Sie die Sekundärantikörper aus der Vertiefung und waschen Sie (x3) kurz in 600 μl PBS-T bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Objektträger aus der Transportbox, geben Sie ihn in einen geeigneten Behälter und waschen Sie überschüssiges PBS-T 15 Minuten lang, wobei Sie die Membran im Dunkeln halten sollten.
12. Entfernen Sie PBS-T und waschen Sie die Membran 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS, um Tween-20-Reste zu entfernen, wobei die Membran wieder im Dunkeln bleibt.
13. Trocknen Sie den Fastslide 10 Minuten lang im 50 °C Ofen und scannen Sie ihn dann auf dem Li-Cor Odyssey Scanner. Bewahren Sie das Objektträger im Dunkeln auf, bis es gescannt wurde.
14. Scannen Sie den Objektträger bei 680 nm und/oder 800 nm, abhängig vom verwendeten Sekundärantikörper/den Sekundärantikörpern. Für die zweifarbige Detektion verwenden Sie immer hochgradig kreuzadsorbierte Sekundärantikörper, um die Kreuzreaktivität zu minimieren. Für die zweifarbige Detektion ist eine sorgfältige Auswahl von Primär- und Sekundärantikörpern erforderlich. Von primärer Bedeutung ist die Auswahl verschiedener Wirtsspezies (z.B. Kaninchen und Maus) für die beiden Primärantikörper. Dies ermöglicht die Unterscheidung von Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Sekundärantikörpern, die mit Farbstoff mit leicht unterscheidbaren Emissionsspektren markiert sind.
15. Bilddateien werden als .tiff Dateien gespeichert. Abbildung 1 zeigt das Bild der gescannten Dateien.

Results

Abbildung 1. Flussdiagramm des RPPA-Scanprozesses.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triton X-100	Triton-X	Nr. T8787
Li-Cor Odyssey Blocking-Puffer	Li-Cor	927-40000
MicroGrid II Roboter-Spotter	Biorobotik
FastFrame' Schiebehalterung mit vier Einschüben	Whatman	10486001
FAST Slide - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT Ziege Anti-Maus IgG	Likör	926-68020
IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen IgG	Likör	Tel.: 926-32211