Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Lösungen
- Stellen Sie eine 50-fache Stammlösung aus E3-Embryomedium her, indem Sie 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 und 9,95 g MgSO4 in 5 l destilliertem Wasser mischen und bei RT lagern.
- Stellen Sie eine 50-fache Stammlösung aus E3-Embryomedium her, indem Sie 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 und 9,95 g MgSO4 in 5 l destilliertem Wasser mischen und bei RT lagern.
- Für die Kultivierung von Zebrafischembryonen verdünnen Sie die 50-fache Stammlösung des E3-Embryomedienmaterials mit destilliertem Wasser zu einer 1-fachen Arbeitslösung, fügen Sie dann 200 μl 0,05 % Methylenblau zu je 1 l 1x E3 hinzu, um als Fungizid zu wirken, und lagern Sie es bei RT.
- Stellen Sie eine pigmentierungsblockierende Lösung aus E3-Embryomedien mit 0,003 % 1-Phenyl-2-thiharnstoff (PTU) her, indem Sie 40 ml des 50x E3-Stammes mit 0,06 mg PTU kombinieren. Bringen Sie dann das Volumen mit destilliertem Wasser auf insgesamt 2 L.
- Rühren Sie das E3/PTU O/N bei RT um, um das PTU-Pulver in Lösung zu bringen. Lagern Sie dann die E3/PTU unter RT.
Anmerkung: Die E3/PTU ist etwa eine Woche haltbar, und ältere Lösungen sind weniger wirksam bei der Blockierung der Pigmentierungsentwicklung bei Zebrafischlarven.
- Stellen Sie eine Anästhesielösung aus 0,2% Tricain (MS-222) her, indem Sie 1 g Tricain zu 500 ml destilliertem Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit 1 M Tris auf 7,2, pH 9,5 einstellen.
>2. Vorbereitung der Werkzeuge
- Bereiten Sie ein Embryo-Manipulator-Werkzeug vor, das zum Positionieren von Embryonen für die Mikroinjektion verwendet wird, indem Sie eine Gelladespitze am Ende einer geraden 5-Zoll-Präpariernadel anbringen und mit Klebeband oder Sekundenkleber sichern.
- Bereiten Sie die Mikroinjektionsnadeln mit einem Nadelabzieher vor, indem Sie zuerst ein feuerpoliertes 10 cm großes Borosilikatglas mit Filament in das Instrument einsetzen und das Borosilikatglas durch Festziehen der Griffe sichern.
- Ziehe am Borosilikatglas, um feine Nadeln zu formen. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Hitze 540, Zugkraft 245, Geschwindigkeit 200 und Zeit 125.
- Legen Sie die Nadeln in eine Petrischale, hängen Sie sie an einen Streifen Modelliermasse, um die Nadelspitzen zu schützen, und halten Sie die Schale abgedeckt, um Staubansammlungen zu vermeiden.
- Um die Vorbereitung der Nadel für Mikroinjektionen abzuschließen, schneiden Sie mit einer Rasierklinge oder einer feinen Pinzette das gezogene Ende der Nadel ab, um eine scharfe, eckige Injektionsspitze mit einem Durchmesser von ca. 0,05 bis 0,1 mm zu erhalten.
- Für die Herstellung der Mikroinjektionsschale eine 1,5%ige Agarose/E3-Lösung in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben zubereiten und die Agarose auflösen, indem das E3 in der Mikrowelle zum Kochen gebracht und dann etwa 10 Minuten lang bei RT abgekühlt wird.
- Gießen Sie die abgekühlte Agarose/E3-Lösung in eine Petrischale, um ein Fundament mit einer Tiefe von ca. 0,5 cm herzustellen. Wenn diese erstarrt ist, gießen Sie eine zweite Schicht mit einer Tiefe von ca. 0,3 cm und setzen Sie den vorgefertigten Embryo ein, formen Sie ihn und lassen Sie die Agarose bei RT erstarren.
Anmerkung: Wenn Sie die Form in die obere Agar/E3-Schicht einsetzen, platzieren Sie die Form in einem Winkel in den Agar, um die Anzahl der Luftblasen zu verringern.
- Wenn die gesamte Mikroinjektionsschale fest geworden ist, heben Sie die vorgefertigte Vertiefung an, formen Sie sie langsam und vorsichtig mit einer Scoopula, füllen Sie dann die Schale mit E3-Lösung und lagern Sie sie bei 4 °C.
>3. Mikroinjektion von Nephrotoxinlösung
- Bereiten Sie am Tag der Injektion die gewünschte Nephrotoxinlösung zusammen mit der entsprechenden Fahrzeugkontrolle vor.
- Vortexen oder vorsichtig mischen, um sicherzustellen, dass das/die Medikament(e) in Lösung ist/sind, und überprüfen Sie die Seiten des Röhrchens und die Oberseite der Wassersäule.
Anmerkung: Nephrotoxinlösungen können so hergestellt werden, dass sie Spuren von fluoreszierend konjugiertem Dextran enthalten, um die Wirksamkeit der Mikroinjektion zu überwachen und auch die renale Clearance zu nachfolgenden Zeitpunkten zu beurteilen.
- Laden Sie eine getrimmte Mikroinjektionsnadel mit ~2–3 μl des Nephrotoxins, indem Sie eine feine Gelladespitze in die Rückseite der Nadel einfädeln und die Nadel vertikal mit einem Stück Klebeband aufhängen, damit die Lösung die getrimmte Nadelspitze durch die Schwerkraft füllen kann.
- Sobald die Nadelspitze voll ist, befestigen Sie die geladene Nadel im Mikromanipulator.
- Testen Sie das Mikroinjektionsvolumen, indem Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerobjektträger geben und in das Öl injizieren, um die Tröpfchengröße zu bestimmen. Ein Injektionsvolumen von 500 pl hat einen Durchmesser von 0,1 mm.
- Nehmen Sie die Schale mit den Embryonen aus dem Inkubator und betäuben Sie, indem Sie etwa 5 ml 0,2% Tricain in die Embryoschale geben.
- Um eine vollständige Betäubung zu gewährleisten, berühren Sie den Embryo vorsichtig mit der Spitze des Embryomanipulator-Werkzeugs. Bewegungsmangel deutet auf eine ausreichende Anästhesie hin.
- Nach erfolgreicher Anästhesie übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in die Spritzgießform.
- Manövriere jeden Embryo in eine andere Vertiefung der Form, indem du den Kopf in den tiefsten Bereich der Vertiefung legst, so dass der Rüssel entlang der Vertiefung aufliegt und der Schwanz aus der Vertiefung herausragt.
- Führen Sie die gefüllte Nadel in den Mikromanipulator ein und positionieren Sie die Nadelspitze neben einem Embryo.
- Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Heckgefäß ein, indem Sie den Joystick nach vorne bewegen und das Fußpedal betätigen, um die Mikroinjektion durchzuführen.
Anmerkung: Eine erfolgreiche Injektion kann daran gemessen werden, wie die Flüssigkeit in den Kreislauf gelangt. Darüber hinaus ermöglicht die Co-Injektion des Nephrotoxinums mit fluoreszierend konjugiertem Dextran dem Forscher, die erfolgreiche Injektion nach dem Eingriff zu überprüfen.
- Ziehen Sie den Joystick vorsichtig zurück, um die Nadel aus dem Embryo zu entfernen.
- Nach der Injektion die Embryonen in ein sauberes Geschirr geben und ausspülen, um das Tricain zu entfernen und durch frisches E3/PTU zu ersetzen.
- Inkubieren Sie den Embryo zum gewünschten Zeitpunkt, um die Morphologie zu beurteilen, die durch Fotografie in Methylcellulose-Einbettmedien dokumentiert werden kann, oder verfahren Sie nach Wunsch für die experimentelle Analyse.
Anmerkung: Die Genesung von Embryonen sollte untersucht werden, um den Prozentsatz der Personen mit Ödemen zu bestimmen, die häufig auf eine Nierenschädigung hinweisen.
