Preparation of Kidney Flat Mount: Ein Verfahren zum Präparieren und Vorbereiten eines Flat Mount für die mikroskopische Analyse der Niere eines adulten Zebrafisches

Zusammenfassung

Quelle: McCampbell, K. K. et al. Analyse der Zusammensetzung und Funktion von Nephronen in der erwachsenen Zebrafischniere.J. Vis. Exp. (2014)

Dieses Video zeigt das Sezieren und Vorbereiten einer flachen Halterung der adulten Zebrafischniere. Die vorbereitete flache Halterung kann für die Probenanalyse unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Dissektion und Präparation der adulten Zebrafischniere aus einer nicht fixierten Tierprobe zur Visualisierung der fluoreszierenden Dextran-Markierung des proximalen Tubulus

1. Euthanasieren Sie den mit Dextran injizierten erwachsenen Zebrafisch, indem Sie ihn für 4–5 Min. in eine Schale mit 0,2 % Tricain, pH 7,0 legen< > Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Fisch eingeschläfert wurde, bevor Sie fortfahren, indem Sie sorgfältig überwachen, ob sich die Kiemen nicht mehr bewegen und das Herz aufgehört hat zu schlagen.
2. Heben Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel aus der Tricainlösung, dekantieren Sie die Lösung und legen Sie das Tier auf ein Taschentuch oder Papiertuch.
3. Mache mit einer scharfen Separierschere einen Schnitt hinter dem Kiemenoperculum und entferne den Kopf.
4. Öffnen Sie sofort den Körper des Fisches mit der Präparierschere, indem Sie einen langen Bauchschnitt vom Kopf bis zum Ansatz der Schwanzflosse machen.
5. Entferne die inneren Organe des Fisches mit einer feinen Pinzette.
6. Verwenden Sie superfeine Präpariernadeln, um die Körperwände zu öffnen, um das Nierenorgan sichtbar zu machen, das an der Rückenwand des Tieres haftet.
7. Löse die Niere mit einer feinen Pinzette von der Rückenwand.
8. Legen Sie die Niere vorsichtig in ein 5-ml-Glasfläschchen mit 1X PBS und waschen Sie sie 3 Mal mit 3–5 mL frischem 1X PBS für jeweils 5 Minuten.
   Anmerkung: Die Verwendung eines Glasfläschchens für die Handhabung von Nierenproben bei Erwachsenen erleichtert die Visualisierung des Gewebes und ermöglicht Waschungen mit großen Volumina (bezogen auf die Gewebemasse) von ca. 3-5 ml. Alternativ kann auch eine 12-Well-Zellkulturschale verwendet werden. Während ein Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff verwendet werden konnte, konnten die Röhrchen in Standardgröße (1,5 mL) das Waschen einschränken.
9. Entfernen Sie die Niere mit einer Transferpipette und legen Sie sie mit 1-2 Tropfen 1X PBS auf einen sauberen Objektträger.
10. Verwenden Sie eine feine Pinzette, drücken Sie die Niere auf dem Objektträger flach und stellen Sie sicher, dass sich kein Gewebe gekräuselt oder anderweitig auf sich selbst gekippt hat.
    Anmerkung: Alternativ kann ein Wolframdrahtwerkzeug verwendet werden, um kleine Schnitte in das Bindegewebe zu setzen, um eine abgeflachte Positionierung der Niere zu erleichtern.
11. Legen Sie auf jede Ecke eines 18 x 18 mm großen Glasdeckglases kleine Stücke Modelliermasse und setzen Sie das Deckglas langsam auf die Niere.
    Anmerkung: Winkeln Sie das Deckglas während des Platzierens leicht an, um das Einschließen von Luftblasen in der Lösung zu minimieren. Die Vertiefungen der Modelliermasse haben einen Durchmesser von ca. 2 mm (Abbildung 1A). Alternativ können Divots mit Vakuumfett anstelle von Modelliermasse ersetzt werden. Fügen Sie bei Bedarf einen zusätzlichen Tropfen 1X PBS hinzu, um den Raum zwischen Deckglas und Glasobjektträger zu füllen.
12. Beobachten und/oder bilden Sie die Niere ab, indem Sie den Objektträger auf einem Stereomikroskop oder Verbundmikroskop mit dem entsprechenden Filter in das Sichtfeld bringen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Präparation und Anwendung der Flat-Mount-Niere von adulten Zebrafischen zur Visualisierung der konjugierten Dextranaufnahme im PCT-Segment von Nierennephronen. (ein)Hellfeldbild einer flachen Präparation einer Nierenprobe, bei der das Organ flach auf einem Objektträger positioniert wurde, mit einem Deckglas auf dem Gewebe, das auf vier Vertiefungen Modelliermasse (pinkfarbene Farbe) r...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1X PBS			Hergestellt durch Verdünnen von 10 x PBS in destilliertem Wasser.
Feine Pinzette	Roboz	RS-1050	Dumont Pinzette Muster #55
Glas-Rutsche	Thermo-Fischer	Artikel-Nr.: 4445	Weißer Frost
Glas-Deckglas	Thermo-Fischer	12-540A	18 x 18 mm
Knetmasse	Hasbro	Playdoh	Andere Modelliermassen können substituiert werden und funktionieren ähnlich.
Folienhalter	Thermo-Fischer	Nr. 12-587	Optional: Kartonschale zum flachen Aufbewahren von Objektträgern.
stereomikroskop	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blau GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/ FITC; 83457 P-TRITC	verwendete Filtersatz war wie folgt: Der Hoechst/DAPI-Filter wurde für den Nachweis von DAPI, Propidiumiodid, Dextrankaskadenblau und alkalischer Phosphatase verwendet. GFP/FITC-Filter wurden für die Detektion von Dextran-FITC, Dextran-Luzifergelb und AntiGFP verwendet. Der TRITC-Filter wurde für die Dextran-Fluor-Rubin-, PI- und DBA-Detektion verwendet.
Verbundwerkstoff-Mikroskop	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Rot	verwendete Filtersatz war wie folgt: Der Hoechst/DAPI-Filter wurde für den Nachweis von DAPI, Propidiumiodid, Dextrankaskadenblau und alkalischer Phosphatase verwendet. GFP/FITC-Filter wurden für die Detektion von Dextran-FITC, Dextran-Luzifergelb und AntiGFP verwendet. Der Texas Red-Filter wurde für die Dextran-Fluor-Rubin-, PI- und DBA-Detektion verwendet.