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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Fixierung, Dissektion, Permeabilisierung und Entfernung der Pigmentierung der adulten Zebrafischniere
- Bereiten Sie eine frische Fixierlösung aus 4 % Paraformaldehyd (PFA)/1X PBS/0,1 % DMSO vor oder tauen Sie ein gefrorenes Aliquot aus 4 % PFA/1X PBS auf und fügen Sie 0,1 % DMSO hinzu.
ACHTUNG: PFA ist giftig und PFA-Lösungen sollten an einer Chemikalienhaube gehandhabt werden, während geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und ein Laborkittel, getragen werden. Darüber hinaus sollte PFA-Pulver bei der Herstellung der Stammlösung mit Vorsicht behandelt werden.
- Füllen Sie eine Sezierschale mit genügend Fixierlösung, um das gesamte Tier einzutauchen.
- Den ausgewählten Zebrafisch einschläfern und in Fixierlösung montieren.
Anmerkung: Bei dem ausgewählten Fisch kann es sich um eine unbehandelte Zebrafisch-Nierenprobe oder um eine Niere handeln, die von einem Zebrafisch isoliert wurde, der zuvor eine intraperitoneale Dextran-Injektion erhalten hat.
- Fixieren Sie den O/N der Probe (12–16 Stunden) auf 4 °C.
- Am nächsten Tag wird die Niere mit einer feinen Pinzette vorsichtig von der dorsalen Körperwand gelöst und das Organ mit einer Transferpipette in ein Glasfläschchen gelegt.
HINWEIS: Alternativ kann eine 12-Well- oder 24-Well-Kulturschale verwendet werden. Während ein Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff verwendet werden könnte, könnten die Röhrchen in Standardgröße (1,5 mL) das Waschen einschränken.
- Waschen Sie die präparierte Niere 3 Mal mit 3–5 ml 1X PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 Minuten.
- Entfernen Sie das 1X PBS mit 0,05 % Tween und spülen Sie die Niere 30 min lang mit 3 mL einer 5%igen Saccharoselösung (in 1X PBS).
- Ersetzen Sie es durch 3 mL 30%ige Saccharoselösung (in 1X PBS) und lagern Sie O/N (12–16 Stunden) bei 4 μC.
HINWEIS: Die Saccharoselösungen permeabilisieren die Zellmembranen und ermöglichen anschließend eine spezifische Markierung der Reagenzien, während sie in das Gewebe eindringen.
- Am nächsten Tag die 30%ige Saccharoselösung entfernen und die Niere 2 mal mit 5 mL 1X PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 min waschen.
- Ersetzen Sie das 1X PBS durch 0,05% Tween mit 3–5 ml Bleichlösung, um die auf dem Nierenorgan vorhandene Melanozytenpigmentierung zu entfernen.
- Stellen Sie das Glasfläschchen auf einen Rotator und beobachten Sie genau, wie die Pigmentierung verschwindet.
HINWEIS: Die Depigmentierung dauert in der Regel etwa 20 Minuten, wenn sie nach der Saccharosebehandlung durchgeführt wird, gelegentlich kann sie aber auch bis zu 60 Minuten dauern. Wenn die Bleichlösung zu lange auf der Niere verbleibt, kann es zu einem Zerfall des Organs kommen. Es wird empfohlen, die Probe alle 10–15 Minuten zu überwachen, um die Integrität des Gewebes zu überprüfen.
- Wenn die Pigmentierung aus der Niere entfernt wurde, waschen Sie sich zweimal mit 3–5 ml 1X PBS mit 0,05 % Tween.
- Ersetzen Sie das 1X PBS durch 0,05 % Tween mit 3–5 ml 4 % PFA-Lösung für 1 Stunde bei RT.
- Entfernen Sie die 4%ige PFA-Lösung und waschen Sie die Niere 3 Mal mit 3–5 mL 1X PBS mit 0,05% Tween für jeweils 5 Minuten.
HINWEIS: Sobald die Fixierung abgeschlossen ist, kann die Niere auch auf einen Glasobjektträger montiert und auf die Dextranaufnahme ohne Melanozytenpigmentierung untersucht werden.
- Entfernen Sie das 1X PBS mit 0,05% Tween und ersetzen Sie es durch 3–5 ml Blocklösung, dann inkubieren Sie die Niere bei RT im Block für 2 Stunden.
- Wenn die Blockierung abgeschlossen ist, fahren Sie direkt mit dem ausgewählten Färbeprotokoll fort.
HINWEIS: Die Niere kann nun durch ein oder mehrere andere Verfahren bearbeitet werden, um Markierungsstudien mit verschiedenen Reagenzien durchzuführen.