Expansion Pathology: Ein Verfahren zur hochauflösenden optischen Bildgebung klinischer Gewebeproben

>1. In situ Polymerisation von Proben

1. Inkubieren Sie die Probe in einer Verankerungslösung.
   1. Bereiten Sie die Verankerungslösung vor (in der Regel reichen 250 μl aus, um den Gewebeschnitt zu bedecken), indem Sie die AcX-Stammlösung in 1x PBS auf eine Konzentration von 0,03 mg/ml für Proben verdünnen, die mit Nicht-Aldehyd-Fixiermitteln fixiert sind, oder 0,1 mg/ml für Proben, die mit Aldehyd-Fixiermitteln fixiert sind, die weniger freie Amine für die Reaktion mit AcX zur Verfügung haben.
   2. Legen Sie den Objektträger in eine 100 mm Petrischale und pipettieren Sie die Verankerungslösung über das Gewebe. Mindestens 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
2. Inkubieren Sie die Proben in Gelierlösung.
   1. Bereiten Sie mindestens das 100-fache überschüssige Volumen der Gelierlösung vor. Pro 200 μl wird Folgendes in der angegebenen Reihenfolge kombiniert: 188 μl Monomerlösung, 4 μl 0,5 % 4HT-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration: 0,01 %), 4 μl 10 %ige TEMED-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration 0,2 %) und 4 μl 10 %ige APS-Stammlösung (1:50 Verdünnung, Endkonzentration 0,2 %).
      HINWEIS: Die Gelierlösung sollte unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden. Die Lösung sollte bei 4 °C aufbewahrt werden und die APS-Lösung sollte zuletzt hinzugefügt werden, um ein vorzeitiges Gelieren zu verhindern.
   2. Entfernen Sie die überschüssige Lösung aus dem Gewebeschnitt und legen Sie den Objektträger in eine 100 mm Petrischale. Geben Sie frische, kalte Gelierlösung in die Probe und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 4 °C auf dem Gewebe, um die Diffusion der Lösung in das Gewebe zu ermöglichen.
3. Auf dem Objektträger wird eine Kammer um die Probe herum konstruiert (Abbildung 1A), ohne die Gelierlösung zu stören.
   1. Stellen Sie Abstandshalter für die Gelierkammer her, indem Sie mit einem Diamantmesser dünne Stücke des Deckglases schneiden.
      HINWEIS: Um die Bildgebung nach der Expansion zu erleichtern, sollten die Abstandshalter nahe an der Gewebeprobe sein, um die Menge an Blankgel über dem Gewebe zu reduzieren. Das Glas Nummer 1,5 kann für klinische Standardproben (5−10 μm) verwendet werden. Deckglasstücke können für dickere Proben gestapelt werden.
   2. Befestigen Sie die Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebes mit Wassertröpfchen (~10 μL).
   3. Setzen Sie vorsichtig einen Deckglasdeckel über den Objektträger und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen über dem Gewebe eingeschlossen werden (Abbildung 1B).
4. Die Probe wird bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung (z. B. in einer geschlossenen Petrischale mit einem feuchten Tuch) für 2 h.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die Objektträgerkammer kann in einer verschlossenen Petrischale bei 4 °C gelagert werden.

>2. Probenaufschluss

1. Entfernen Sie den Deckel der Gelierkammer, indem Sie vorsichtig eine Rasierklinge unter das Deckglas schieben und das Deckglas langsam von der Geloberfläche abheben. Schneiden Sie das Blankgel um das Gewebe herum, um das Volumen zu minimieren. Schneiden Sie das Gel asymmetrisch, um die Ausrichtung des Gels nach der Homogenisierung zu verfolgen, da die Probe transparent wird.
   1. ProK vor Gebrauch in Aufschlusspuffer (Endkonzentration 4 U/ml) um 1:200 verdünnen. Bereiten Sie genügend Lösung vor, um das Gel vollständig einzutauchen. Eine einzelne Vertiefung einer Zellkulturplatte aus Kunststoff mit vier Vertiefungen erfordert mindestens 3 ml pro Vertiefung.
   2. Die Probe wird in einem geschlossenen Behälter mit dem Aufschlusspuffer 3 h lang bei 60 °C inkubiert. Wenn sich die Probe während des Aufschlusses nicht vom Objektträger löst, verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Probe vorsichtig zu entfernen.
      HINWEIS: Die Probe sollte vollständig in Aufschlusspuffer getaucht werden, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, und in einen abgedeckten Behälter (kleine Objektträgerbox, Plastikvertiefung, Petrischale usw.) gelegt werden, der mit Folie verschlossen werden kann.

>3. Probenerweiterung und Bildgebung

1. Verwenden Sie einen weichen Pinsel, um die Probe in 1x PBS in einen Behälter zu überführen, der mit dem gewünschten Bildgebungssystem kompatibel und groß genug ist, um das vollständig expandierte Gel aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe mit der Probenseite nach unten platziert wird, wenn die Bildgebung auf einem invertierten System erfolgt, oder mit der Oberseite der Bildgebung auf einem aufrechten System, um den Abstand vom Bildgebungsobjektiv zur Probe zu minimieren. Drehen Sie das Gel bei Bedarf mit einem weichen Pinsel um.
   Anmerkung: Die seitliche Beleuchtung durch eine LED kann verwendet werden, um sie in Flüssigkeit sichtbar zu machen. Eine Standard-6-Well-Platte kann Proben aufnehmen, die einen vorexpandierten Durchmesser von weniger als 0,6 cm haben. Für die Bildgebung auf einem invertierten System sollte eine Vertiefungsplatte mit Glasboden verwendet werden.
2. Waschen Sie die Proben in 1x PBS bei RT für 10 min. Falls gewünscht, färben Sie die Probe erneut mit 300 nM DAPI, da der Aufschlussprozess den DAPI-Fleck wegspült. Entfernen Sie PBS und färben Sie es mit 300 nM DAPI, verdünnt in 1x PBS für 20 min bei RT, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche mit 1x PBS bei RT.
   HINWEIS: Die Proben können mit 1x PBS bedeckt und bei 4 °C gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
3. Um die Proben zu erweitern, ersetzen Sie das PBS und waschen Sie es mit einem überschüssigen Volumen von ddH₂O (mindestens das 10-fache des endgültigen Gelvolumens) 3-5 Mal für jeweils 10 Minuten bei RT.
   Anmerkung: Nach der 3^. oder 4^. Wäsche sollte die Ausdehnung der Probe ein Plateau erreichen. Zur Lagerung kann das ddH₂O zur Verhinderung des Bakterienwachstums mit 0,002 %-0,01 % Natriumazid (NaN₃) ergänzt werden. In diesem Fall wird der Endexpansionsfaktor reversibel um 10 % reduziert.
4. Führen Sie die Fluoreszenzbildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop, einem konfokalen Mikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem Ihrer Wahl durch.
   Anmerkung: Um ein Abdriften der Gele zu verhindern, kann überschüssige Flüssigkeit aus der Vertiefung entfernt werden. Gele können auch mit 1,5-2 % Low-Melt-Agarose immobilisiert werden. Bereiten Sie 1,5-2 %ige (w/v) niedrigschmelzende Agarose in Wasser in einem Behälter mit dem 2- bis 4-fachen Volumen der Lösung vor. Erwärmen Sie die Lösung in einem 40 °C warmen Wasserbad oder in der Mikrowelle für 10-20 s, um die Lösung zu schmelzen. Pipettieren Sie die geschmolzene Agarose an den Rändern des Gels. Nachdem Sie die Agarose bei RT oder 4 °C aushärten ließen, fügen Sie der Probe Wasser hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern.

Abbildung 1: Gelierungskammer für pathologische Proben. (A) Zwei Abstandshalter, wie z. B. zwei mit einem Diamantmesser geschnittene Stücke #1.5 Deckglas, werden auf beiden Seiten des Gewebes platziert, nachdem die Probe in Gelierlösung bei 4 °C inkubiert wurde. Die Abstandshalter sollten dicker sein als die Gewebescheiben, um eine Kompression der Probe zu verhindern. (B) Ein Deckel, z. B. ein Stück Deckglas #1,5, wird verwendet, um die Probe vor der Inkubation bei 37 °C abzudecken.