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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Lateraler Pipettenzugang zur Niere unterhalb einer Flüssigkeitsbildgebungssäule über ein neuartiges chirurgisches Verfahren
HINWEIS: Die Montage des Bildgebungsunterstützungssystems und der chirurgischen Vorbereitung ist in Abbildung 1 dargestellt. Das beschriebene Verfahren wird an C57BL/6 Mäusen mit einem Gewicht von 20–25 g durchgeführt.
- Wiegen Sie die Maus.
- Induzieren Sie die Anästhesie mit 4 % Isofluran und halten Sie sie mit 1,5–2,5 % Isofluran in einem Luft-Sauerstoff-Gemisch aufrecht. Vergewissern Sie sich, dass die Maus betäubt ist, da sie nicht auf schmerzhafte Reize reagiert und die Atemfrequenz verringert ist.
- Schmieren Sie die Augen ein und positionieren Sie das Tier seitlich auf einer Grundplatte. 4 Extremitäten mit Klebeband ruhigstellen.
- Injizieren Sie normale Kochsalzlösung (200 μl) subkutan und setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein. Kontrollieren Sie die Temperatur mit einer Heizlampe während der Operation und einem Heizkissen während der Bildgebung.
- Entfernen Sie alle Haare auf der linken Seite der Maus mit einer Enthaarungscreme.
- Lokalisieren Sie die Milz, die unter der Haut sichtbar ist, und lokalisieren Sie die linke Niere auf der dorsalen und kaudalen Seite der Milz.
- Machen Sie einen 0,5 cm langen Schnitt auf der Haut und einen kleineren Schnitt am Bauchfell, gerade genug, damit die Niere leicht durchdrücken kann.
- Extrudieren Sie die Niere mit sanftem Druck. Legen Sie die Form eines Nierenstabilisators aus Polysiloxan um die Niere und fixieren Sie ihn mit Cyanacrylatkleber. Richten Sie die Niere so mit dem Abstandshalter aus, dass die äußerste Oberfläche der Niere etwa 1 mm über den Stabilisator hinausragt.
- Befestigen Sie eine Kopfplatte mit Kleber an der Stabilisatorform und befestigen Sie die Kopfplatte an den Befestigungsstangen an der Grundplatte.
- Füllen Sie die Vertiefung in der Polysiloxanstütze, die die Niere umgibt, mit 1%iger Agaroselösung, legen Sie das 10 mm Deckglas darauf und halten Sie es fest, bis die Agarose fest ist. Versiegeln Sie das Deckglas mit Klebstoff auf der Kopfplatte und formen Sie mit Zahnzement einen Ring um das Deckglas.
- Injizieren Sie FITC-Dextran (2.000.000 Da, 5%ige Lösung, 100–150 μl) retroorbital und bewegen Sie die Maus und die Fixierungsplatte schnell in den 2-Photonen-Mikroskoptisch, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten und eine ausreichende Abgasabsaugung auf dem Mikroskoptisch zu gewährleisten.
>2. Auswahl eines geeigneten Glomerulus und Pipettenzugangs zum Bowman's Space
- Definitionen:
- Definieren Sie X als links-rechts auf dem Bildschirm und links-rechts zum Mikroskop zeigend
- Lesen von SX (Stufe X) vom Stage-Controller
- Definieren Sie PX als Pipette X auf dem Pipettierregler
- Definieren Sie Y auf dem Bildschirm nach oben, nach unten und nach vorne in Richtung des Mikroskops und zurück in Richtung des 2-Photonen-Setups
.
- Definieren Sie Z als oben zur Decke, nach unten zum Boden und gemessen auf der Bühne mit der Zielposition Z.
- Definieren Sie S(O)Z als die Bühnenhöhe (eigentlich die Zielhöhe).
- Ermitteln Sie die Oberfläche der Niere, erkennbar anhand der Filtereinstellungen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) im Okular. Durch die Injektion von FITC-Dextran wird das Gefäßsystem hellgrün.
- Identifizieren Sie einen geeigneten Glomerulus. Nachdem Sie die Oberfläche der Niere mit dem Okular identifiziert haben, wechseln Sie in den 2-Photonen-Modus (nicht scannender Modus) und erkunden Sie das Bildgebungsfenster. Günstige Eigenschaften für die Mikropunktion sind: vertikaler Abstand unter dem Deckglas >30 μm (um eine Kollision zwischen Pipette und Deckglas beim Zugang zu verhindern) und lateraler Abstand von der lateralen Nierenkapsel zum Glomerulus <400 μm (über diesen Abstand hinaus kann die Abweichung der Pipette die Wahrscheinlichkeit eines Fehlschlags erhöhen).
- Notieren Sie den lateralen und vertikalen Abstand zur Punktionsstelle, einem Punkt auf der Nierenkapsel direkt zur Pipettenseite des Glomerulus.
- Heben Sie den objektiven Brennpunkt in die Wassersäule an, wobei die Koordinaten der x- und y-Stufe unverändert bleiben, nur etwa einen Zentimeter.
- Treiben Sie die Pipettenspitze in die Wassersäule und schalten Sie die 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Anregung ein. Bewegen Sie die Pipette in den x- und y-Dimensionen bis zum Punkt der maximalen Fluoreszenz der Spitze, dies ist die Mitte des Objektivs. Die Pipette im Okular zu finden, ist ohne diese präzise Vorpositionierung schwierig. Da Quantenpunkte unabhängig von der Anregungswellenlänge mit der gleichen (in diesem Fall roten) Wellenlänge fluoreszieren, erzeugt die DAPI-Anregung eine rote Fluoreszenz, die eng auf die Spitze fokussiert ist, wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Ändern Sie die Anregungseinstellung auf rotes fluoreszierendes Protein (RFP) und visualisieren Sie die Pipette im Okular, dann zentrieren Sie sie präzise in der Okularansicht.
- Wechseln Sie zu 2-Photon und suchen Sie die Pipette unter 2-Photon und platzieren Sie sie genau in der Mitte des Bildes. Dies ist die Registrierungsposition.
- Speichern Sie ein Bild der Pipette.
- Registrieren Sie den Tisch und die Koordinaten der Mikropipettensteuerung.
Anmerkung: Verwenden Sie die ergänzende .html-Datei, die Berechnungen mit JavaScript-Code ausführt (vorteilhaft auf Systemen, auf denen keine Tabellenkalkulationssoftware installiert ist) oder eine Tabelle, um den Versatz zwischen Tisch- und Pipettenkoordinaten und die Zielkoordinaten für die Pipettiersteuerung zu berechnen.
- Entfernen Sie die Pipette aus der Wassersäule in der x-Achse, wobei z und y gleich bleiben.
- Bewegen Sie die Pipette Z zum Zielglomerulus Z (d.h. bewegen Sie die Pipette in Z-Richtung nach unten unter dem Deckglas)
- Bewegen Sie die Pipette Y auf die Y-Koordinate des Zielglomerulus.
- Verschieben Sie die 2-Photonen-Live-Ansicht auf den Zielglomerulus Z und dann an den Rand der Niere und notieren Sie sich den SX.
- Berechnen Sie den Nierenrand PX mit dem Offset aus der Registrierung SX.
- Bewegen Sie den Tisch in Richtung Pipette (erhöhen Sie den SX-Wert), so dass der Rand der Niere weit links vom Bildschirm liegt, aber immer noch sichtbar ist.
- Schieben Sie die Pipette schnell auf etwa 100 μm weniger als den oben berechneten Nierenrand PX vor.
- Positionieren Sie die Pipettenspitze und schieben Sie die Pipette langsam voran. Erhöhen Sie die Rotverstärkung und beobachten Sie das Histogramm der roten Pixel (die Pixelverteilung verschiebt sich, bevor die Pipette im Fenster abgebildet wird, aufgrund der extremen Helligkeit von Quantenpunkten und der Off-Target-Fluoreszenz).
- Vorrücken bis zum Nierenrand unter Live-2-Photonen-Bildgebung.
Anmerkung: Vor dem Eintritt in die Nierenkapsel ist es möglich, die Pipette in die Dimensionen Y und Z umzulenken. Dies kann jedoch dazu führen, dass die Pipettenspitze gebrochen wird. Eine konservativere Maßnahme, wenn die Pipette daneben liegt, besteht darin, in der X-Dimension bis zu 2 cm zurückzuziehen, umzuleiten und dann in der X-Dimension zum Nierenrand zurückzukehren. Sobald sich die Pipette im Gewebe befindet, führt eine Bewegung in einer anderen Achse als X zu einer Pipettenflexion, die viel Erfahrung erfordert und häufig zum Bruch führt.
- Fahren Sie die Pipette in der X-Achse langsam zum Glom-Ziel PX und behalten Sie dabei die SX im Auge. (Es ist hilfreich, gelegentlich zum Glomerulus zurückzukehren, um zu sehen, ob er sich beim Einsetzen der Mikropipette überhaupt verschoben hat.)
- Wenn Sie sich an der richtigen Stelle befinden, positionieren Sie das Dokument mit einem Z-Stapel.
Anmerkung: Wenn die Mikropipette an Ort und Stelle ist, können Medikamente, Proteine oder fluoreszierende Tracer injiziert, Flüssigkeit für eine spätere Analyse abgesaugt oder Druck oder Ladung relativ zu einer anderen Elektrode gemessen werden.
>3. Aspiration von Flüssigkeit aus Bowmans Raum
- Stellen Sie die Mikropumpe so ein, dass sie 100 nL Perfluordecalin über einen Zeitraum von 2 Minuten injiziert, um die Durchgängigkeit der Pipette sicherzustellen und Verwirrungen durch das Verstopfen der Pipette während des Eintritts zu reduzieren. Reimaging zur Sicherstellung der Pipettenposition.
- Warten Sie 4–6 Minuten auf eine weitere Filtration.
- Stellen Sie die Mikropumpe so ein, dass sie bis zu 300 nL mit einer Rate von bis zu 50 nL/min aspiriert
Anmerkung: Veränderungen in der glomerulären Morphologie werden bei dieser Rate nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass sie die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsabgabe in den Raum während der Aspiration nicht verändert. Da es keinen Ölblock wie bei der herkömmlichen Mikropunktion gibt, könnte die für die Massenspektrometrie notwendige Gewinnung dieses Volumens einen Teil des injizierten Perfluorodecalins und möglicherweise die röhrenförmige Flüssigkeit umfassen. Für Assays wie ionenempfindliche Elektrodenmessungen, Fluoreszenzspektroskopie, Polymerase-Kettenreaktion und andere empfindliche Endpunkte können niedrigere Volumina verwendet werden. Wenn die Massenspektrometrie nicht der Endpunkt ist, können Mineralöl und Standard-Mikropunkturtechniken verwendet werden, um das aspirierte Volumen vor der Lagerung zu messen.
- Bild noch einmal.
- Ziehen Sie die Pipette heraus und konservieren Sie die Probe, fügen Sie TRIS-Puffer hinzu und lagern Sie sie vor der Analyse bei -80°
.
- Euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran oder einer anderen zugelassenen Methode.
Anmerkung: Das Filtrat gelangt durch Filtration aus den glomerulären Kapillaren in den Raum. Die glomeruläre Filtrationsrate (SNGFR) von Einzelnephronen bei Mäusen wird zwischen 8 und 14 nL/min angegeben. Die Starenkräfte bestimmen jedoch die SNGFR, und der negative hydrostatische Druck im Bowman-Raum kann daher die SNGFR erhöhen. Herkömmliche Mikropunkturmethoden verwenden eine röhrenförmige Blockade mit Öl und neutralem Druck für die Probenahme von röhrenförmiger Flüssigkeit, diese Verbindungen beeinträchtigen jedoch die Massenspektrometrie (siehe unten); Daher bleibt bei dieser Technik der frühe proximale Tubulus offen. Darüber hinaus enthält der Bowman-Raum zum Zeitpunkt der Aspiration ein unbekanntes, aber positives Volumen an Filtrat. Daher kann die Flüssigkeitsaspirationsrate SNGFR.
überschreiten
Anmerkung: In den hier beschriebenen Experimenten bestand das Ziel darin, eine größere Probe als üblich glomeruläres Filtrat für die massenspektrometrische Analyse mit nanoproteomischen Techniken zu erhalten. Da die Verwendung der Massenspektrometrie die Verwendung von Ölblöcken mit Mineralöl oder Wachs (komplexe Mischungen organischer Moleküle, die das Signal-Rauschen in der Massenspektrometrie reduzieren) ausschließt, wird Perfluordecalin zum Befüllen der Mikropipette und der Spritze verwendet. Es ist nicht bekannt, dass Perfluordecalin die röhrenförmige Strömung blockiert, aber biologisch inert ist und die Massenspektrometrie nicht beeinträchtigt.
