Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
>1. Herstellung von Minireservoirs für die Kultivierung von embryonalen Nieren und Nierenorganoiden von Mäusen auf Hühner-CAM und Aufbau von Xenotransplantationsexperimenten
- Verwenden Sie Transwell-Zellkultureinsätze, die für 6-Well- oder 12-Well-Platten ausgelegt sind.
Anmerkung: Je nach Experiment können große oder kleine Minireservoirs verwendet werden. Es ist am besten, kleine Minireservoirs für die Xenotransplantation von bis zu acht embryonalen Nieren zu verwenden oder wenn mehrere Minireservoirs auf denselben Hühnerembryo platziert werden (z. B. Experiment- und Kontrollproben auf demselben Hühner-CAM).
- Schneiden Sie die Seiten der Einsätze mit einem rotierenden Multitool mit einem Kreissägeblatt oder einer Handsäge ab, um einen 2 mm hohen Kunststoffring zu erhalten, an dem eine durchlässige Membran befestigt ist.
- Polieren Sie die Kanten dieser Minireservoirs mit einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
- Sterilisieren Sie die Minireservoirs mindestens 1 h lang in 70%igem Ethanol.
- Waschen Sie die Minireservoirs in autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie sie in einer laminaren Haube trocknen.
- Spülen Sie die Minireservoirs mit PBS und Kulturmedium (DMEM mit hohem Glukosegehalt/10 % FBS/1 % Penicillin-Streptomycin).
- Legen Sie das Reservoir in eine Petrischale und legen Sie es mit der Membran nach oben auf einen Tropfen (600 μl/400 μl) Kulturmedium.
- Ordnen Sie präparierte ex vivo embryonale Nieren oder Nierenorganoide mit Hilfe einer Pipette oder eines Glaskapillarrohrs gleichmäßig auf der Membran an. Vermeiden Sie es, viel Flüssigkeit um die Nieren herum zu lassen.
- Lassen Sie die Proben 2–24 h lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2,
an der Membran haften
Anmerkung: Bis zu acht embryonale E11.5-Mausnieren oder Nierenorganoide können auf dem kleinen Einsatz angeordnet werden. Der große Einsatz wird empfohlen, wenn entweder größere Stücke embryonalen Gewebes für die Xenotransplantation oder ein Zell-Hydrogel-Gemisch auf einer größeren Fläche der CAM verwendet werden.
- Nehmen Sie 8 Tage alte, ex ovo kultivierte embryonale Hühner, die nach zuvor veröffentlichten Methoden hergestellt wurden, aus dem Zellkultur-Inkubator
- Übertragen Sie die Minireservoirs so auf das CAM, dass die Transplantate dem CAM zugewandt sind und die Membran sie überlagert. Platzieren Sie die Minireservoirs so in der Peripherie des CAM, dass sie den Hühnerembryo nicht bedecken.
Anmerkung: Bei der Verwendung kleinerer Minireservoirs, die aus Transwell-Einsätzen für 12-Well-Platten hergestellt werden, können bis zu drei Minireservoirs auf einem CAM platziert werden.
- Geben Sie 500 μl (6-Well-Einsatz) oder 300 μl (12-Well-Einsatz) Kulturmedium in die Minireservoirs.
- Kultivieren Sie die Proben auf Hühner-CAM für maximal 9 Tage. Wechseln Sie das Nährmedium täglich in die Minireservoirs.
Anmerkung: Eine Vaskularisation der Proben kann bereits 24–48 h nach der Transplantation beobachtet werden.
