$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Stereotaktische Einheiten für die Operation vorbereiten
- Schalten Sie alle Anästhesiegeräte, digitalen Nonius-Waagen und digitalen Injektoren ein.
Anmerkung: Alle chirurgischen Instrumente sollten vor der Operation ausreichend gereinigt und sterilisiert werden.
- Verwenden Sie Anästhesiegeräte mit einem Induktionskammeraufsatz in einer biologischen Sicherheitswerkbank (Abbildung 1A).
- Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche von Anästhesiegeräten mit den stereotaktischen Rahmen verbunden sind (Abbildung 1B, Einschub 1C) und die Klemmen an den Schläuchen für alle verwendeten Einheiten geöffnet sind. Schließen Sie alle Klemmen an Schläuchen, die zu stereotaktischen Rahmen führen, die nicht für die Operation verwendet werden.
- Stellen Sie die Anästhesiegeräte auf die vom Hersteller empfohlene Flussrate für den Nasenkonus basierend auf dem Gewicht der Maus ein (z. B. 25 g Tiergewicht: Flussrate des Nasenkonus 34 mL/min).
Anmerkung: Der in diesem stereotaktischen Setup enthaltene Kopfhalter wird nur für erwachsene Mäuse empfohlen. Stellen Sie sicher, dass die Herstellerempfehlungen, die im stereotaktischen Setup enthalten sind, befolgt werden.
- Stellen Sie sicher, dass das geeignete Anästhetikum (z. B. Isofluran), das in der Spritze vorgefüllt ist, am Anästhesiegerät befestigt ist (Abbildung 1B).
Anmerkung: Eine Übergrundierung der Spritze kann dazu führen, dass den Mäusen während der Operation zu viel Anästhesie verabreicht wird, was zu einer Überdosierung des Anästhetikums führt.
- Bereiten Sie die Bohrer vor, indem Sie die Tischverriegelung drehen, einen Bohreradapter und einen 1-mm-Bohrer in jeden Bohrer einsetzen und den Bohrer durch manuelles Festziehen der Bit-Arretierung arretieren.
- Befestigen Sie Bohrer an den stereotaktischen Rahmen (Abbildung 1C).
>2. Platzieren von Mäusen auf stereotaktischen Frames
- Betäuben Sie Mäuse (z. B. Isofluran) mit der bereits erwähnten Induktionskammer.
- Halten Sie die Mäuse während des gesamten Eingriffs in tiefer Anästhesie. Der prozentuale Anteil der Anästhesie, der vom Gerät verabreicht wird, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter: Flussrate, Stimulationsgrad und Körpertemperatur. Überwachen Sie die Mäuse während des gesamten Eingriffs häufig auf die Tiefe der Anästhesie, indem Sie auf rhythmische Atmung untersuchen (das Tier keucht nicht); Mangel an Lidreflex (Flattern der Augenlider bei Stimulation mit einem Wattestäbchen-Applikator); und fehlendes Einklemmen der Zehen (Zurückziehen der Gliedmaßen bei dem schädlichen Reiz des Einklemmens der Zehen).
Anmerkung: Unterschiedliche Mäusestämme reagieren unterschiedlich auf die Anästhesie.
- Nachdem sich die Mäuse in einer geeigneten, tiefen Anästhesieebene befinden, übertragen Sie die Mäuse in die stereotaktische Einheit. Verwenden Sie ein Heizkissen, während sich die Maus auf dem stereotaktischen Gerät befindet, um die Körpertemperatur und eine geeignete Anästhesieebene aufrechtzuerhalten.
Anmerkung: Um ein niedriges Profil zu erreichen, verwenden wir luftaktivierte Handwärmer, die in einer umgekehrten Pipettenspitzenbox platziert sind (Maus-Elevationsbox in Abbildung 1D).
- Öffnen Sie den Mund der Maus und platzieren Sie die Zähne in der Mulde des Mundbügels, die sich am Nasenstück auf dem stereotaktischen Rahmen befindet (Abbildung 2A). Schieben Sie den Nasenkegel über die Nase/den Mund der Maus (Abbildung 2B).
- Platzieren Sie die Mäuse mit dem Kopf auf gleicher Höhe zur Maulstange. Öffnen Sie den Mund vorsichtig mit dem stumpfen Ende eines Wattestäbchen-Applikators und schieben Sie ihn an seinen Platz. Stellen Sie sicher, dass sich der Nasenkegel vollständig über der Nase der Maus befindet, da sonst die Anästhesie nicht richtig verabreicht wird. Der Nasenkonus greift nicht in die Nase ein, wenn die Zähne nicht in dieser Nut sitzen (Einschub Abbildung 2A).
- Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen Augenschmiermittel auf jedes Auge der Maus auf. Das Auftragen von Augengleitmittel mildert das Austrocknen der Hornhaut und verringert die Wahrscheinlichkeit von Hornhautschäden und postoperativen Komplikationen im Zusammenhang mit einem Hornhauttrauma.
- Stabilisieren Sie den Schädel der Maus, indem Sie den linken Ohrbügel gegen den medialen Canthus des linken Ohrs drücken und ihn mit der Schraube am stereotaktischen Rahmen fixieren. Schieben Sie dann die rechte Ohrstange gegen den medialen Canthus des rechten Ohrs und schrauben Sie sie fest auf den stereotaktischen Rahmen (Abbildung 2B).
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus gerade und gerade ist, wenn Sie Ohrstangen platzieren. Wenn der Kopf schief oder abgewinkelt ist, befindet sich die Injektion an der falschen Stelle im Gehirn. Die Ohrbügel sollten NUR so lange festgezogen werden, bis der Schädel nach der Stimulation mit moderater manueller Sondierung ruhiggestellt ist.
>3. Erstellen eines Schädeldachfensters
- Bereiten Sie die Kopfhaut vor und reinigen Sie sie mit jeweils 3x abwechselnden Durchgängen einer Betadinlösung und 70% Ethanol. Aufgrund der Nähe der Operationsstelle zu den Augen verwenden Sie die Betadin-Lösung über dem OP-Peeling.
- Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 3 mm großen Schnitt durch die Haut entlang der zentralen medianen Seite des Schädels (entlang der sagittalen Nahtlinie). Die Blutung am Schnitt sollte minimal sein. Sollte dies der Fall sein, üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen-Applikator >30 Sekunden lang gleichmäßigen, festen Druck auf die Blutungsstelle aus.
- Identifizieren und richten Sie den Bohrer senkrecht zum Bregma aus (Abbildung 2C), und stellen Sie sicher, dass die digitale Nonius-Skala auf Null zurückgesetzt ist.
- Bewegen Sie den Bohrer 2 mm lateral zur sagittalen Naht und 1 mm vor der koronalen Naht (Abbildung 2C). Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass die Position links oder rechts der sagittalen Nahtlinie bei allen Tieren konsistent bleibt.
- Drehen Sie den Bohrer auf die höchste Drehzahl. Stellen Sie sicher, dass die Haut vom Bohrer weg bewegt wird, um Gewebeschäden durch den rotierenden Bohrer zu vermeiden, und initiieren Sie den Bohrer vorsichtig auf dem Schädel. Bohren Sie ein etwa 0,5 mm tiefes Loch durch den Schädeldach, wodurch das Schädeldachfenster entsteht. Achten Sie darauf, den Bohrer nicht zu weit abzusenken, da er sich sonst in das Gehirn bohrt. Wenn Sie sterile Kochsalzlösung auf die Bohrstelle fallen lassen, während der Bohrer in Bewegung ist, kann die von der Maschine erzeugte Wärme, die das umgebende Gewebe thermisch schädigen kann, ausgleichen.
- Sobald das Kalvarienbergfenster hergestellt ist, heben Sie den Bohrer vorsichtig an und entfernen Sie ihn aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Reinigen Sie die Bohrer mit 70 % Ethanol und legen Sie sie bei erneuter Verwendung beiseite. Wenn nicht, entfernen Sie die Bohrer und tauchen Sie sie in 70%iges Ethanol.
