Mikroglia-Phagozytose-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Etablierung eines Mikroglia-Phagozytose-Modells für Neuroblastomzellen unter Verwendung von iPSC-Makrophagen

Zusammenfassung

Quelle: Hall-Roberts, H. et al. In vitro Quantitative Bildgebung Assay für die Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video führen wir den mikroglialen Phagozytose-Assay für Neuroblastome mit induzierten pluripotenten Stammzellen durch. Der Assay hilft bei der Beurteilung der Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Protokoll

>1. Markierung von toten SH-SY5Ys mit pH-sensitivem rotem Fluoreszenzfarbstoff

1. Beginnen Sie mit fixierten SH-SY5Y-Zellen, die in phenolrotfreien, HEPES-gepufferten Medien suspendiert sind. Zählen Sie die Zellen und entnehmen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen in ein 2-ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Für jeweils 1 Million SH-SY5Ys ist das Gesamtvolumen im 2-ml-Röhrchen auf 300–500 μl mit phenolrotfreiem, HEPES-gepuffertem Medium aufzufüllen. Erwärmen Sie die Tube kurz in einem 37 °C warmen Wasserbad.
2. Rekonstituieren Sie den pH-empfindlichen roten Fluoreszenzfarbstoff STP-Ester (siehe Materialtabelle) und geben Sie 12,5 μg Farbstoff pro Million SH-SY5Y in das warme 2-ml-Zellröhrchen. Vorsichtig durch Pipettieren mischen. Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt.
   Anmerkung: Die STP-Esterspezies des pH-sensitiven Farbstoffs reagiert mit primären Aminen, daher darf der Markierungspuffer keine freien Amine enthalten. Aufgrund der möglicherweise eingeschränkten Löslichkeit in wässrigen Puffern den DMSO-gelösten Farbstoff nur hinzufügen, um den wässrigen Puffer zu erwärmen, sofort mischen und auf Anzeichen von Niederschlag (dunkle Partikel unter einem Lichtmikroskop) untersuchen.
3. 1 mL HBSS zugeben und bei 1200 x g 7 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und mit 2 mL HBSS waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation.
4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in phenolrotfreien Makrophagenmedien (siehe Materialtabelle) auf eine Konzentration von 200.000–1,2 Millionen Zellen/ml, so dass 50 μl 10.000–60.000 Zellen entsprechen (d.h. 0,5x–3x mehr SH-SY5Ys als iPSC-Makrophagen).
   Anmerkung: Phenolrot in Medien erhöht die Hintergrundfluoreszenz, und daher sollten phenolrotfreie Medien verwendet werden, wenn eine Bildgebung von lebenden Zellen durchgeführt werden soll. Eine Lagerung des verschmutzten SH-SY5Ys für mehr als ein paar Stunden wird nicht empfohlen, da dies nicht bewertet wurde. Bewahren Sie fleckige SH-SY5Ys auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht.

>2. Färbung von iPSC-Makrophagen

1. In einer biologischen Sicherheitswerkbank wird in Makrophagenmedien eine Lösung eines tiefrot fluoreszierenden, zellpermeanten, Succinimidylester-reaktiven Farbstoffs hergestellt (siehe Materialtabelle). Fügen Sie Hoechst 33342 hinzu (siehe Materialtabelle). Erwärmen Sie die Arbeitslösung im Wasserbad auf 37 °C.
2. Aspirieren Sie das iPSC-Makrophagenmedium schonend, indem Sie den Zellüberstand mit einer Mehrkanalpipette in ein steriles Reservoir pipettieren. 70 μl/Vertiefung der in Schritt 2.1 hergestellten Farbstofflösung mit einer Mehrkanalpipette in iPSC-Makrophagen geben. 1 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
3. Bereiten Sie experimentelle Behandlungen in phenolrotfreien Makrophagenmedien vor. Nehmen Sie 10 μM Cytochalasin D als Negativkontrollbehandlung auf. Nach der Inkubation das iPSC-Makrophagenmedium sehr vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette aspirieren und 100 μl/Vertiefung Hank's Buffered Kochsalzlösung (HBSS) zum Waschen hinzufügen. Entfernen Sie HBSS sofort durch vorsichtiges Pipettieren und fügen Sie dann 100 μl Medium ± Verbindungen hinzu. 10 min–1 h bei 37 °C und 5 % CO₂,
   inkubieren Anmerkung: Cytochalasin D ist ein potenter Aktinhemmer und blockiert die Phagozytose. Bei experimentellen Behandlungen, die eine längere Inkubation erfordern, z. B. 24–72 Stunden, ist die experimentelle Behandlung vor Schritt 2.1 durchzuführen, wobei 100 μl/Vertiefung der Behandlung in vollem Makrophagenmedium verwendet werden. Befolgen Sie die Schritte 2.1 bis 2.3 gemäß dem Protokoll, so dass die Zellfärbung durchgeführt wird und anschließend die Behandlung für den Rest des Phagozytose-Assays in phenolrotfreien Makrophagenmedien erneut angewendet wird.

>3. Bildgebende Phagozytose

1. High-Content-Bildgebung mit fixierten Zellen
   1. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl des markierten SH-SY5Ys pro Vertiefung hinzuzufügen, und geben Sie es an die Seite jeder Vertiefung am Rand der Flüssigkeit. Bei 37 °C und 5 % CO₂ 3-5 h inkubieren.
   2. Nach der Phagozytose-Inkubation die Zellüberstände durch Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig aspirieren und verwerfen. Einmal mit 100 μl PBS waschen.
   3. Die Platte durch Zugabe von 100 μl 2 % Paraformaldehyd fixieren und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Aspirieren Sie die Vertiefungen und fügen Sie 100 μl PBS hinzu. Mit Plattenversiegeler und Folie abdecken; Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
      Anmerkung: Die Assay-Platte kann auf diese Weise mindestens eine Woche lang gelagert werden, ohne dass das Signal wesentlich beeinträchtigt wird. Eine längere Lagerung wurde nicht getestet.
   5. Schalten Sie das High-Content-Bildgebungsmikroskop ein (siehe Materialtabelle) und öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware. Legen Sie die Assay-Platte in das Mikroskop ein, indem Sie auf das Symbol Laden am oberen Bildschirmrand klicken.
   6. Wählen Sie die Registerkarte Setup aus. In den Dropdown-Menüs des oberen linken Feldes: Wählen Sie den entsprechenden Plattentyp aus, wählen Sie die Autofokus-Option Two Peak (Standard), wählen Sie das Objektiv 40x Wasser, NA1.1, wählen Sie den konfokalen Modus und wählen Sie Binning von 1.
   7. Spülen Sie das 40-fache Wasserobjektiv vor der Verwendung über das Einstellungsmenü.
   8. Verwenden Sie im Feld Kanalauswahl das +-Symbol, um die Kanäle DAPI, Alexa 647 und Alexa 568 hinzuzufügen. Stellen Sie diese so ein, dass sie in einer einzelnen Ebene von 1 μm gemessen werden. Optimieren Sie die Zeit- und Energieeinstellungen für die Färbeeffizienz der Assay-Platte.
      Anmerkung: Stellen Sie als Richtlinie DAPI auf 200 ms Belichtung und 100 % Leistung, Alexa 647 auf 1500 ms Belichtung und 100 % Leistung und Alexa 568 auf 100 ms Belichtung und 40 % Leistung ein.
   9. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle nicht gleichzeitig gemessen werden, indem Sie auf Kanalsequenz klicken, um die Kanäle zu trennen.
   10. Unter Navigation | Definieren Sie das Layout, wählen Sie die Messvertiefungen aus und wählen Sie 9 bis 12 Felder pro Vertiefung aus.
   11. Klicken Sie während der Einrichtung auf ein repräsentatives Feld auf der Plattenkarte und überprüfen Sie nacheinander jeden Messkanal, um sicherzustellen, dass die Färbung vorhanden ist und die Bilder fokussiert sind, indem Sie den Kanalversatz anpassen.
   12. Wenn Daten zur Remote-Analyse auf einen Server hochgeladen werden sollen, klicken Sie auf das Feld Online-Jobs und den entsprechenden Bildschirmnamen. Dies ermöglicht das automatische Hochladen der Daten auf einen Server nach dem Imaging.
   13. Speichern Sie das Assay-Protokoll, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken.
   14. Klicken Sie oben auf die Registerkarte Experiment ausführen, benennen Sie die Experimentplatte und klicken Sie dann auf Start.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mL	Falke	352096	Zur Zentrifugation von Zellen
2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL Einkanal-Mikropipetten
4% Paraformaldehyd in PBS	Alfa Aesar	Nr. J61899	Zur Fixierung von Zellen
6-Well-Platte, Gewebekultur behandelt
AggreWell-800 24-Well-Platte	STEMCELL-Technologien	Artikel-Nr.: 34815	Microwell-24-Well-Platte mit geringer Adhärenz für die Bildung von Embryoidkörpern
Automatisierter Zellzähler
Tisch-Zentrifuge
Tisch-Mikrozentrifuge
CellCarrier-96 Ultra Mikrotiterplatten, gewebekulturbehandelt, schwarz, 96-well mit Deckel	Perkin Elmer	6055302	Mit 96-Well-Gewebekulturen (TC) behandelte Mikroplatten mit schwarzen Well-Wänden und optisch klarem Boden für den Phagozytose-Assay
CellProfiler-Software			Open-Source-Software für die Analyse von Phagozytosebildern, die mit einem Zeitraffermikroskop für lebende Zellen aufgenommen wurden. Laden Sie es kostenlos von der Website (http://cellprofiler.org/) herunter, dieses Protokoll verwendet Version 2.2.0.
CellTracker Deep Red Farbstoff	Thermo Fischer	Nr. C34565	Tiefrot fluoreszierender, zellpermeanter, Succinimidylester-reaktiver Farbstoff zur Färbung des Zytoplasmas von iPS-Makrophagen. Löse den CellTracker Deep Red Farbstoff in DMSO auf 2 mM (1,4 mg/ml) auf. Bei 1 μM durch Verdünnung von DMSO-Stamm mit Makrophagenmedien verwenden.
Sicherheitswerkbank für laminare Luftströmung der Klasse 2
CO2-Gasflasche			Zubehör für EVOS FL Auto
CO2-Inkubator, eingestellt auf 37°C und 5 % CO2
Cytochalasin D	Kaiman	Artikel-Nr.: 11330	Negativkontrollbehandlung für Phagozytose-Assays. Rekonstituieren Sie in DMSO auf 10 mM und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C, um weitere Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Bei einer Endkonzentration von 10 μM verwenden.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Bestandteil der SH-SY5Y-Medien
Dmso	Sigma	Nr. D8418	Lösungsmittel für CellTracker und pHrodo Farbstoffe
Fötales Rinderserum	Sigma	Nr. F4135	Bestandteil der SH-SY5Y-Medien
Geltrex LDEV-freie, hESC-qualifizierte, Basalmembran-Matrix mit reduziertem Wachstumsfaktor	Invitrogen	A1413302	hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix für die iPS-Kultur
GlutaMAX Ergänzung	Gibco	Artikel-Nr.: 35050-038	Bestandteil von Werks- und Makrophagenmedien
HBSS	Lonza	BE 10-547F	Hank's ausgewogene Salzlösung für Waschschritte
Humane rekombinante IL-3	Gibco	PHC0033	Bestandteil von Werks- und Makrophagenmedien
Lösung für die Bildgebung lebender Zellen	Thermo Fischer	A14291DJ	Phenolrot-freie, HEPES-gepufferte Medien zur Etikettierung von toten SH-SY5Ys
2 ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung	Eppendorf	Artikel-Nr.: 30108.132	Zum Färben SH-SY5Ys
M-CSF	Thermo Fischer	PHC9501	Bestandteil von Werks- und Makrophagenmedien
mTeSR1 Mittel	STEMCELL-Technologien	Artikel-Nr.: 85850	iPSC-Medien
Mehrkanalpipette mit 20-200 μl			Für das Liquid Handling von 96-Well-Platten
NucBlue Live ReadyProbes Reagenz	Thermo Fischer	Nr. R37605	Hoechst 33342 Formulierung in einer Tropfflasche zur Färbung von Zellkernen von iPS-Makrophagen, verwenden Sie 0,5 Tropfen/ml in Makrophagenmedien.
Opera Phenix High-Content-Screening-System	Perkin Elmer	HH14000000	High-Content-Bildgebungsmikroskop, das mit der Harmony-Software Version 4.9 verwendet wird.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122	Komponente von Factory-, Macrophage- und SH-SY5Y-Medien
pHrodo iFL Rot STP-Ester	Thermo Fischer	Nr. P36011	pH-empfindlicher roter Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung von toten SH-SY5Ys. Rekonstituieren Sie pHrodo iFL Red STP Ester Pulver in DMSO auf eine Konzentration von 5 mg/ml. Geben Sie für jeweils 1 Million SH-SY5Ys 2,5 μl (12,5 μg) pHrodo iFL Red STP Ester zu vorgewärmten Zellen, die in Live Cell Imaging Solution suspendiert sind.
Serologischer Pipettenfüller
T175-Kolben, mit Gewebekultur behandelt			Gefäß zur Differenzierung von iPSC-Makrophagen-Vorläufern, bekannt als "Factories"
T75-Kolben			Gefäß für SH-SY5Y-Kultur
Transparente Plattenversiegeler	Greiner Bio-One	676001	Für die Lagerung und den Transport von Assay-Platten
Wasserbad, eingestellt auf 37°C
X-VIVO 15 Medium mit L-Glutamin, Gentamicin und Phenolrot	Lonza	BE04-418F	Bestandteil von Fabrik- und Makrophagenmedien
X-VIVO 15 Medium mit L-Glutamin; ohne Gentamicin oder Phenolrot	Lonza	Tel.: 04-744Q	Phenolrotfreie Makrophagenmedien, für den Einsatz in der Phagozytose ohne Zusatzstoffe oder Wachstumsfaktoren