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Methodenartikel
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30. April 2023
Quelle: Hall-Roberts, H. et al. In vitro Quantitative Bildgebung Assay für die Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. J. Vis. Exp. (2021)
In diesem Video führen wir den mikroglialen Phagozytose-Assay für Neuroblastome mit induzierten pluripotenten Stammzellen durch. Der Assay hilft bei der Beurteilung der Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen.
>1. Markierung von toten SH-SY5Ys mit pH-sensitivem rotem Fluoreszenzfarbstoff
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mL | Falke | 352096 | Zur Zentrifugation von Zellen |
| 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL Einkanal-Mikropipetten | |||
| 4% Paraformaldehyd in PBS | Alfa Aesar | Nr. J61899 | Zur Fixierung von Zellen |
| 6-Well-Platte, Gewebekultur behandelt | |||
| AggreWell-800 24-Well-Platte | STEMCELL-Technologien | Artikel-Nr.: 34815 | Microwell-24-Well-Platte mit geringer Adhärenz für die Bildung von Embryoidkörpern |
| Automatisierter Zellzähler | |||
| Tisch-Zentrifuge | |||
| Tisch-Mikrozentrifuge | |||
| CellCarrier-96 Ultra Mikrotiterplatten, gewebekulturbehandelt, schwarz, 96-well mit Deckel | Perkin Elmer | 6055302 | Mit 96-Well-Gewebekulturen (TC) behandelte Mikroplatten mit schwarzen Well-Wänden und optisch klarem Boden für den Phagozytose-Assay |
| CellProfiler-Software | Open-Source-Software für die Analyse von Phagozytosebildern, die mit einem Zeitraffermikroskop für lebende Zellen aufgenommen wurden. Laden Sie es kostenlos von der Website (http://cellprofiler.org/) herunter, dieses Protokoll verwendet Version 2.2.0. | ||
| CellTracker Deep Red Farbstoff | Thermo Fischer | Nr. C34565 | Tiefrot fluoreszierender, zellpermeanter, Succinimidylester-reaktiver Farbstoff zur Färbung des Zytoplasmas von iPS-Makrophagen. Löse den CellTracker Deep Red Farbstoff in DMSO auf 2 mM (1,4 mg/ml) auf. Bei 1 μM durch Verdünnung von DMSO-Stamm mit Makrophagenmedien verwenden. |
| Sicherheitswerkbank für laminare Luftströmung der Klasse 2 | |||
| CO2-Gasflasche | Zubehör für EVOS FL Auto | ||
| CO2-Inkubator, eingestellt auf 37°C und 5 % CO2 | |||
| Cytochalasin D | Kaiman | Artikel-Nr.: 11330 | Negativkontrollbehandlung für Phagozytose-Assays. Rekonstituieren Sie in DMSO auf 10 mM und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C, um weitere Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Bei einer Endkonzentration von 10 μM verwenden. |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Bestandteil der SH-SY5Y-Medien |
| Dmso | Sigma | Nr. D8418 | Lösungsmittel für CellTracker und pHrodo Farbstoffe |
| Fötales Rinderserum | Sigma | Nr. F4135 | Bestandteil der SH-SY5Y-Medien |
| Geltrex LDEV-freie, hESC-qualifizierte, Basalmembran-Matrix mit reduziertem Wachstumsfaktor | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix für die iPS-Kultur |
| GlutaMAX Ergänzung | Gibco | Artikel-Nr.: 35050-038 | Bestandteil von Werks- und Makrophagenmedien |
| HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank's ausgewogene Salzlösung für Waschschritte |
| Humane rekombinante IL-3 | Gibco | PHC0033 | Bestandteil von Werks- und Makrophagenmedien |
| Lösung für die Bildgebung lebender Zellen | Thermo Fischer | A14291DJ | Phenolrot-freie, HEPES-gepufferte Medien zur Etikettierung von toten SH-SY5Ys |
| 2 ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung | Eppendorf | Artikel-Nr.: 30108.132 | Zum Färben SH-SY5Ys |
| M-CSF | Thermo Fischer | PHC9501 | Bestandteil von Werks- und Makrophagenmedien |
| mTeSR1 Mittel | STEMCELL-Technologien | Artikel-Nr.: 85850 | iPSC-Medien |
| Mehrkanalpipette mit 20-200 μl | Für das Liquid Handling von 96-Well-Platten | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reagenz | Thermo Fischer | Nr. R37605 | Hoechst 33342 Formulierung in einer Tropfflasche zur Färbung von Zellkernen von iPS-Makrophagen, verwenden Sie 0,5 Tropfen/ml in Makrophagenmedien. |
| Opera Phenix High-Content-Screening-System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-Content-Bildgebungsmikroskop, das mit der Harmony-Software Version 4.9 verwendet wird. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | Nr. 15140-122 | Komponente von Factory-, Macrophage- und SH-SY5Y-Medien |
| pHrodo iFL Rot STP-Ester | Thermo Fischer | Nr. P36011 | pH-empfindlicher roter Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung von toten SH-SY5Ys. Rekonstituieren Sie pHrodo iFL Red STP Ester Pulver in DMSO auf eine Konzentration von 5 mg/ml. Geben Sie für jeweils 1 Million SH-SY5Ys 2,5 μl (12,5 μg) pHrodo iFL Red STP Ester zu vorgewärmten Zellen, die in Live Cell Imaging Solution suspendiert sind. |
| Serologischer Pipettenfüller | |||
| T175-Kolben, mit Gewebekultur behandelt | Gefäß zur Differenzierung von iPSC-Makrophagen-Vorläufern, bekannt als "Factories" | ||
| T75-Kolben | Gefäß für SH-SY5Y-Kultur | ||
| Transparente Plattenversiegeler | Greiner Bio-One | 676001 | Für die Lagerung und den Transport von Assay-Platten |
| Wasserbad, eingestellt auf 37°C | |||
| X-VIVO 15 Medium mit L-Glutamin, Gentamicin und Phenolrot | Lonza | BE04-418F | Bestandteil von Fabrik- und Makrophagenmedien |
| X-VIVO 15 Medium mit L-Glutamin; ohne Gentamicin oder Phenolrot | Lonza | Tel.: 04-744Q | Phenolrotfreie Makrophagenmedien, für den Einsatz in der Phagozytose ohne Zusatzstoffe oder Wachstumsfaktoren |
