Isolierung von Zellkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe: Eine Methode zur Gewinnung intakter Zellkerne aus Gliomtumorproben

Zusammenfassung

Quelle: Narayanan, A. et al. Zellkernisolierung aus frisch gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Isolierung von Einzelkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe. Die isolierten Einzelkerne können als Proben für Sequenzierungstechniken wie die Einzelkern-RNA (snRNA)-Sequenzierung und die Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin (snATAC)-Sequenzierung verwendet werden, um tiefere Einblicke in die inter- und intratumorale Heterogenität zu erhalten, die bei Gliomen des zentralnervösen Gewebes beobachtet wird.

Protokoll

>1. Gewebedissektion und Dissoziation

1. Frische gefrorene Gewebeprobe (10–60 mg) in eine vorgekühlte Petrischalen geben. Frisches gefrorenes Taschentuch mit einer Rasierklinge auf Eis in kleine Stücke zerkleinern/hacken.
2. Geben Sie 500 μl gekühlten Kernlysepuffer in ein vorgekühltes 1,5-ml-Röhrchen. Die Gewebestücke werden in das 1,5-ml-Röhrchen mit dem Zellkernlysepuffer gegeben und in einen Douncer (Table of Materials) überführt.
   Anmerkung: Es gibt zwei Dounce Homogenisator-Stößel: "loser" oder "A"-Stößel für die Erstprobenreduktion und "tight" oder "B"-Stößel für die vollständige Probenhomogenisierung.
3. Die Gewebestücke mit dem "losen" Stößel etwa 20 Züge lang dämpfen, bis die Reibung reduziert ist. Wenn Schmutz vorhanden ist, kann die Probe durch Filtration mit einem 100-mm-Sieb vorgereinigt werden.
4. Mit dem "engen" Stößel 20 Hübe lang dämpfen, um eine vollständige Gewebehomogenisierung zu erreichen.
5. Das Homogenat (ca. 500 μl) wird in ein vorgekühltes 2-ml-Röhrchen überführt. Fügen Sie 1 ml gekühlten Lysepuffer hinzu. Vorsichtig mischen und 5 min auf Eis inkubieren. Vorsichtig mit einer Pipettenspitze mit breiter Öffnung mischen und während der Inkubation 1–2 Mal wiederholen.
6. Das gesamte Homogenat wird mit einem 30-μm-Siebnetz filtriert, in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen aufgefangen und wieder in ein neues, vorgekühltes 2-ml-Röhrchen umgefüllt. In der Regel reicht ein einziges Sieb für das gesamte Homogenat aus.
7. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, ob große Trümmer entfernt werden und ob die Kernmembran intakt ist. Die Kerne müssen rund sein und die Kernmembran darf nicht verzerrt sein. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, können die Zellkerne erneut gefiltert werden.
8. Die Zellkerne werden bei 500 x g für 5 min bei 4 °C auf einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ~50 μL mit einem Pellet zurück, das die Kerne enthält. Das Pellet vorsichtig in weiteren 1 ml Kernlysepuffer resuspendieren und 5 Minuten auf Eis inkubieren.
9. Die Zellkerne werden bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, ohne das Pellet zu stören, 500 mL 1x Homogenisierungspuffer (HB) zugegeben (Tabelle 1) und 5 min ohne erneute Suspendierung inkubiert. Dann resuspendieren Sie die Zellkerne in weiteren 1,0 mL 1x HB.
10. Zentrifugieren Sie die Zellkerne bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellkerne vorsichtig in 200 μl 1x HB in ein neues 2,0 mL Röhrchen.

    Tabelle 1: Herstellung von 1x Homogenisierungspuffer instabile Lösung (2 mL pro Probe)

    kg kg Uhr Uhr kg

    1x Homogenisierungspuffer Instabile Lösung (2 mL pro Probe)
    Reagenz	Finale Konz.	Vol pro Probe (μL)
    6x Homogenisierungspuffer instabil	1x	333,33
    1 M Saccharose	320 mM	640,00
    50 mM EDTA	0,1 mM	4,00
    10% NP40	0,1 %	20.00
    H2Ω		Nr. 1006,27

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250
CaCl2	Sigma	Artikel-Nr.: 21115-100ML
EDTA (0,5 Mio.)	Thermo Scientific	Nr. R1021
Falcon 15 mL konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	352096
MACS SmartSiebe (100 μm)	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-098-463
Mg(Ac)2	Sigma	Artikel-Nr.: 63052-100ML
NP-40	Abcam (Englisch	Artikel-Nr.: ab142227
Zellkern-Isolationskit: Nuclei EZ Prep	Sigma	NUC101-1KT
Safe Lock Röhrchen 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Safe Lock Röhrchen 2,0 mL	Eppendorf	30120094
Saccharose	Sigma	Nr. S0389
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung (1000 μl)	Themo Fisher Scientific	2079GPK

)