Gradientenzentrifugation basierte Reinigung von Kernen: Eine Technik zur Gewinnung einer hochreinen Fraktion intakter Kerne mittels Dichtegradientenzentrifugation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Narayanan, A. et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video beschreiben wir ein einfaches und effizientes Protokoll, das Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne zu isolieren. Nach der Isolierung können diese Zellkerne für die Sequenzierung und Genomanalyse verwendet werden.

Protokoll

>1. Gradienten-Zentrifugation

Fügen Sie 200 μl 50%ige Iodixanollösung hinzu (Tabelle 1), um eine Endkonzentration von 25% Iodixanol zu erhalten. 10 Mal mit einer Pipette auf 300 ml gut mischen.
300 μl 29%ige Iodixanollösung (Tabelle 2) unter die 25%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine feine P1000-Spitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
300 μl 35%ige Iodixanollösung (Tabelle 3) unter die 29%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine feine P1000-Spitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
Vorsicht: Dieser....

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Flussdiagramm für die Kernisolierung. Das Flussdiagramm gibt einen kurzen Überblick über die Schritte, die bei der Isolierung einzelner Zellkerne aus einem frisch gefrorenen Gliomgewebe erforderlich sind. Dargestellt sind repräsentative Bilder für die Tumorprobe und die Kernbande nach dem Jodixanol/Saccharose-Gradienten (eingekreist mit roter gestrichelter Linie).

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