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>1. Gradienten-Zentrifugation
- Fügen Sie 200 μl 50%ige Iodixanollösung hinzu (Tabelle 1), um eine Endkonzentration von 25% Iodixanol zu erhalten. 10 Mal mit einer Pipette auf 300 ml gut mischen.
- 300 μl 29%ige Iodixanollösung (Tabelle 2) unter die 25%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine feine P1000-Spitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
- 300 μl 35%ige Iodixanollösung (Tabelle 3) unter die 29%ige Mischung geben. Verwenden Sie eine feine P1000-Spitze, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
Vorsicht: Dieser Schritt erfordert ein schrittweises Entfernen der Pipettenspitze während des Pipettierens, um eine übermäßige Volumenverschiebung zu vermeiden.
- Die Proben in eine schwingende Schaufelzentrifuge geben, 20 min bei 3.500 x g bei 4 °C bei ausgeschalteter Bremse schleudern.
- Entnehmen Sie die Proben vorsichtig und ohne Schütteln und beobachten Sie sie unter Licht. Zwischen der zweiten und dritten Schicht sollte eine klare weiße Bande aus 95% reinen Kernen sichtbar sein (Abbildung 1).
>2. Isolierung von Kernen
- Aspirieren Sie die oberen Schichten, bis die weißen Kerne in der Zwischenphase von 29 % bis 35 % liegen.
- Die Kernbande wird in einem Volumen von 200 ml gesammelt, in ein frisches Röhrchen umgefüllt und mit einem 20-μm-Filter filtriert (Materialtabelle).
Anmerkung: Die Zellkerne müssen vor der Filtration nicht resuspendiert werden.
- Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop, ob große Trümmer entfernt werden und ob die Kernmembran intakt ist. Die Kerne müssen rund sein, und die Kernmembran sollte nicht verzerrt sein.
- Zählen Sie die Kerne mit Trypanblau-Färbung auf einem Hämozytometer und die aliquoten Kerne für snRNA-seq/snATAC-seq.
Tabelle 1: Zubereitung von 6x Homogenisierungspuffer Stabiler Mastermix
kg
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kg
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| 6x Homogenisierungspuffer Stabiler Mastermix |
| Reagenz | Finale Konz. | Vol für 100 (mL) |
| 1 M CaCl₂ | 30 mM | 3,0 |
| 1 M mg(Ac)₂ | ca. 18 Mio. | 1,8 |
| 1 M Tris pH 7,8 | 60 mM | 6,0 |
| H₂O | | 89,2 |
| Bei Raumtemperatur aufbewahren, direkte Lichteinwirkung vermeiden |
Tabelle 2: Zubereitung von 1 M Saccharose
| 1 M Saccharose |
| 34,23 g Saccharose |
| In 78,5 mL Wasser auflösen |
| Füllen Sie bis zu 100 mL mit Wasser |
Tabelle 3: Herstellung von 6x Homogenisierungspuffer instabile Lösung (650 μl pro Probe)
kg
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kg
| 6x Homogenisierungspuffer instabile Lösung (650 mL pro Probe) |
| Reagenz | Finale Konz. | Vol pro Probe (μL) |
| 6x Homogenisierungspuffer stabil | 6-fach | 648,84 |
| 100 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) | 0,1 mM | 1,08 |
| 14,3 M β-Mercaptoethanol | 1 mM | 0,08 |
