Schnitt von gefrorenem Maushirngewebe: Ein Verfahren zur Gewinnung dünner gefrorener Gewebeschnitte aus gefrorenem Maushirngewebe

Zusammenfassung

Quelle: Comba, A. et al. Laser-Capture-Mikrodissektion von Gliom-Subregionen zur räumlichen und molekularen Charakterisierung von intratumoraler Heterogenität, Onkostreams und Invasion. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir das Schneiden eines gefrorenen Hirntumorgewebes einer Maus mit einem Kryostaten. Die so gewonnenen gefrorenen Hirngewebeschnitte werden bis zur weiteren Analyse bei niedrigen Temperaturen gelagert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Schneiden von gefrorenem Hirntumorgewebe

1. Beschriften Sie 2 μm Objektträger aus Polyethylennaphthalat (PEN) mit den Probeninformationen. Die Gewebeschnitte werden nach dem Schnitt direkt auf diese Objektträger gelegt.
2. Stellen Sie die Temperatur der Kryostatkammer zwischen -20 und -24 °C ein. Legen Sie den Probenblock vor dem Schneiden in die Kryostatkammer und lassen Sie ihn 30–60 Minuten lang auf die Temperatur in der Kammer ausgleichen.
3. Reinigen Sie die Kryostatenkammer und den Messerhalter mit 100% Ethanol und besprühen Sie die zu verwendenden Bürsten mit RNase Reinigungslösung. Entfernen Sie in der Kryostatkammer die Form und befestigen Sie den OCT-Block mit dem Gehirn an der Kryostat-Probenscheibe mit OCT. Legen Sie den Block in den Scheibenhalter und richten Sie den Block mit der Messerklinge aus.
4. Setzen Sie eine Einwegklinge in den Trennhalter ein.
5. Schneiden Sie das Gehirn bei einer Dicke von 10 μm. Stellen Sie sicher, dass sich keine Schlieren oder Kratzlinien im Taschentuch befinden. Mit einem Pinsel das Tuch vorsichtig flach drücken und auf der Schnittfläche aufrollen.
6. Montieren Sie das Gewebe mit den Gehirnschnitten vorsichtig auf RNase-freie PEN-Glasobjektträger. Drehen Sie die positiv geladenen Objektträger mit den Fingern in Richtung Gewebe und drücken Sie den Objektträger sanft nach unten in Richtung Gewebeschnitt.
   Anmerkung: Die Temperatur der Hände hilft dem Gewebe, sich am Glas zu befestigen.
7. Nachdem Sie die Hirnschnitte auf die Objektträger montiert haben, bewahren Sie die Objektträger in einer Box in der Kryostatkammer auf und lagern Sie sie dann bei -80 °C. Bewahren Sie die Objektträger niemals bei Raumtemperatur auf.
   Anmerkung: Falten des Gewebes und Reißen sind häufig. Für eine genaue posteriore Analyse ist es wichtig, diese Artefakte zu minimieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PEN Membran Glasobjektträger (2 μm)	Lieca	1150518
Kryostat für die Forschung	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Dekontaminationslösung	Fisher Scientific	AM9780
Entfernen Sie Einweg-Einbettungsformen	Elektronenmikroskopie	70182
Punktgenaue Lösung	Zymo-Forschung	Nr. D3001-1
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	Tel.: 23-730-571