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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Fixierung und Färbung von kryokonservierten Hirngewebeschnitten
- Um die RNA-Integrität zu erhalten, reinigen Sie alle zu verwendenden Instrumente mit RNase-Reinigungslösung. Fahren Sie mit dem Fixierungs- und Färbeprotokoll in einem Abzug fort.
- Bereiten Sie die beschriebenen Fixierlösungen in sauberen RNase-freien 50-ml-Röhrchen vor. Stellen Sie alle Lösungen am Tag der Färbung mit RNase-freiem Wasser her.
- Am selben Tag wird die Lasermikrodissektion durchgeführt, wobei 100%, 95%, 70% und 50% Ethanollösungen hergestellt werden. Bewahren Sie die Lösungen in dicht verschlossenen Röhrchen bei Raumtemperatur auf.
- Bereiten Sie 4 % Cresylviolett und 0,5 % Eosin Y in 75 % Ethanollösung vor. Wirbeln Sie die Lösung 1 Minute lang kräftig vor und filtrieren Sie sie durch einen 0,45 μm Nylonfilter, um Spuren von ungelöstem Pulver zu entfernen.
- Legen Sie die Objektträger für 30 s in ein Gefäß mit 95 % Ethanol. Übertragen Sie die Objektträger in das Röhrchen mit 75 % Ethanol und lassen Sie die Objektträger dort 30 s lang.
- Übertragen Sie die Objektträger auf 50% Ethanol und lassen Sie sie dort 25 s lang. Zu diesem Zeitpunkt wird das OCT aufgelöst. Den Objektträger für 20 s in 4%ige Cresylviolettlösung und dann für 5 s in 0,5%ige Eosin-Y-Lösung überführen.
- Nehmen Sie den Objektträger aus der Färbelösung und tupfen Sie den Objektträger mit einem Filterpapier trocken. Legen Sie dann die Objektträger 25 s lang in 50%iges Ethanol. Übertragen Sie die Objektträger für 25 s auf 75% Ethanol. Übertragen Sie die Objektträger 30 s lang auf 95% Ethanol. Übertragen Sie die Objektträger für 60 s auf 100% Ethanol.
- Spülen Sie den Objektträger mit Xylol ab. Füllen Sie sie in einen Behälter mit Xylol und warten Sie 3 Minuten.
- Bereiten Sie das Eindeckmedium (z. B. Pinpoint-Gummi) in RNase-freiem Wasser vor. Um Hirnschnitte von Mäusen zu montieren, verdünnen Sie das Einbettmedium in RNase-freiem Wasser im Verhältnis 1:10.
- Trocknen Sie die Objektträger auf einer RNase-freien Oberfläche bei Raumtemperatur für 10 s. Bevor das Xylol trocknet, fahren Sie mit der Montage der Objektträger mit den Gewebeschnitten fort.
- Verteilen Sie die Einbettlösung vorsichtig mit einem sterilen und RNase-freien, dünnen Pinsel auf dem Gewebe. Warten Sie 10–20 s und übertragen Sie dann sofort die Gewebeobjektträger auf die Mikrodissektionsplattform des Mikroskops.
HINWEIS: Das Verhältnis von Einbettmedium zu RNasefreiem Wasser, das für die Einbettung verwendet wird, variiert je nach dem zu berücksichtigenden Gewebe. Das Einbettmedium/Wasser-Verhältnis bewahrt die Morphologie des Gliomgewebes für die Lasermikrodissektion, ohne die RNA-Integrität zu beeinträchtigen.