$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Einzelzell-Suspensionspräparat aus dem Gehirn
- Verdünnen Sie das Dichtegradientenmedium im Verhältnis 9:1 mit PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen, um eine endgültige 100%ige Lösung zu erhalten.
- Betäuben Sie Mäuse zu Beginn des EAE-Peaks mit einer intraperitonealen Injektion von 1 % Natrium-Pentobarbital (50 mg/kg) und perfundieren Sie intrakardial mit 20 ml sterilem, eiskaltem PBS. Erreichen Sie dies, indem Sie PBS langsam und stetig mit einer 20-ml-Spritze in den linken Ventrikel des Herzens injizieren und den rechten Vorhof öffnen.
- Schneiden Sie den Schädel vorsichtig von der Nase bis zum Hals und nehmen Sie dann das Gehirn aus der Schädelbox in 10 ml RPMI in konischen 50-ml-Röhrchen. Gut mischen, um anhaftende rote Blutkörperchen zu entfernen. Entfernen Sie dann das Medium durch Aspiration und fügen Sie 10 mL RPMI hinzu.
- Geben Sie das Gehirn und das Medium in eine 100-mm-Schale. Mit einer Rasierklinge fein hacken.
- Übertragen Sie 6 mL aus der Schale mit einer sauberen Pipette in einen eiskalten 7 mL Sinterglas-Homogenisator. Vermeiden Sie es, große Mengen Gewebe in der Pipette zu belassen. Eine kleine Menge ist unvermeidlich.
- Mahlen Sie das Gehirn zuerst mit dem "losen" Kolben des Stößels, dann verwenden Sie den "festen" Kolben, bis die Suspension homogen ist, und gießen Sie es in ein vorgekühltes konisches 15-ml-Röhrchen und halten Sie es auf Eis.
- Nachdem alle Proben homogenisiert sind, schätzen Sie das Volumen. Stellen Sie das Volumen mit RPMI auf 7 mL ein. Geben Sie dann 3 ml eiskalte 100%ige Basalmembranmatrix in ein gekühltes konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 7 ml des Gehirnhomogenats hinzu, um ein endgültiges Gradientenmedium mit 30 % Dichte zu erhalten. Ein paar Mal durch Inversion mischen. Nicht wirbeln.
- Um eine scharfe Grenzfläche zu gewährleisten, fügen Sie vorsichtig und langsam 1 ml 70 % Underlay-Dichtegradientenmedium in RPMI mit einer 3-ml-Pipette hinzu.
- Zentrifugieren Sie bei 800 x g für nur 20 min bei 4 °C. Stellen Sie die Beschleunigung auf 1 und die Verzögerung auf 0. Nach der Zentrifugation wird fast die gesamte obere Phase aspiriert, wobei darauf zu achten ist, dass das Myelin an der Spitze vollständig entfernt wird (Abbildung 1).
- Entfernen Sie die Schnittstelle in ein neues 15-Zentrifugenröhrchen. Stellen Sie das Volumen mit RPMI auf 10 mL ein.
- Bei 500 x g 10 min zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt. Resuspendieren Sie das Pellet in ~200 μl Puffer für die Durchflusszytometrie-Färbung (FSC).
