Immunaffinitätsbasierte Extraktion von ubiquitinylierten Peptiden: Eine Technik zur selektiven Extraktion von Ubiquitin-markierten Peptiden aus gereinigten Peptidfraktionen

Zusammenfassung

Quelle: Bezstarosti, K. et al. Detektion von Protein-Ubiquitinierungsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie. J. Vis. exp. (2020)

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Extraktion und Reinigung von ubiquitinylierten Peptiden, die Reste von Diglycin-Peptiden aus einer komplexen Peptidmischung enthalten. Das vorgestellte Verfahren kann dabei helfen, ursprüngliche Ubiquitinierungsstellen im Protein zu identifizieren.

Protokoll

>1. Extraktion von ubiquitinylierten Peptiden

1. Verwenden Sie eine Umkehrphasen-C18-Chromatographie (RP) mit hohem pH-Wert mit polymerem stationärem Phasenmaterial (300 Å, 50 μM; siehe Materialtabelle), das in eine leere Säulenpatrone geladen wird, um die tryptischen Peptide zu fraktionieren. Die Größe des stationären Phasenbetts muss an die Menge des zu fraktionierenden Proteinverdaus angepasst werden. Bereiten Sie eine leere 6-ml-Säulenpatrone (siehe Materialtabelle) vor, die mit 0,5 g stationärem Phasenmaterial für ~10 mg Proteinverdau gefüllt ist. Das Verhältnis von Proteinverdau zu stationärer Phase sollte etwa 1:50 (w/w) betragen.
2. Laden Sie die Peptide auf die vorbereitete Säule und waschen Sie die Säule mit etwa 10 Säulenvolumina mit 0,1 % TFA, gefolgt von etwa 10 Säulenvolumina H2O.
3. Eluieren Sie die Peptide in drei Fraktionen mit 10 Säulenvolumina von 10 mM Ammoniumformiatlösung (pH = 10) mit 7 %, 13,5 % bzw. 50 % Acetonitril (AcN). Lyophilisieren Sie alle Fraktionen bis zur Vollständigkeit.
4. Verwendung von Ubiquitin-Restmotiv-Antikörpern (K-ε-GG), die an Protein-A-Agarosekügelchen konjugiert sind, für die Immunanreicherung von diGly-Peptiden. Da die genaue Menge an Antikörpern pro Charge von Beads urheberrechtlich geschützte Informationen sind und vom Hersteller nicht offengelegt werden, wird empfohlen, für eine Charge von Beads die gleiche Definition wie für den Hersteller zu verwenden, um Verwechslungen zu vermeiden. Waschen Sie eine Charge dieser Kügelchen 2x mit PBS und teilen Sie die Bead-Aufschlämmung in sechs gleich große Fraktionen. In Abbildung 1 finden Sie ein detailliertes experimentelles Schema.
5. Die drei in Schritt 1.3 gesammelten Peptidfraktionen werden in 1,4 ml eines Puffers gelöst, der aus 50 mM MOPS, 10 mM Natriumphosphat und 50 mM NaCl (pH = 7,2) besteht, und schleudern Sie die Rückstände ab.
6. Die Überstände der Fraktionen werden zu den diGly-Antikörperkügelchen gegeben und 2 h bei 4 °C auf einer Rotatoreinheit inkubiert. Die Kügelchen werden heruntergeschleudert, der Überstand wird in eine frische Charge von Antikörperkügelchen überführt und erneut 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert.
7. Bewahren Sie die Überstände für die nachfolgende Analyse des globalen Proteoms (GP) auf.
8. Übertragen Sie die Kügelchen aus jeder Fraktion in eine 200-μl-Pipettenspitze, die mit einem GF/F-Filterstopfen ausgestattet ist, um die Kügelchen zurückzuhalten. Setzen Sie die Pipettenspitze mit den Kügelchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein, das mit einem Zentrifugenspitzenadapter ausgestattet ist. Waschen Sie die Kügelchen 3x mit 200 μL eiskaltem IAP-Puffer und anschließend 3x mit 200 μL eiskaltem Milli-Q H₂O. Schleudern Sie die Säule vor jedem Waschschritt 2 min lang bei 200 x g herunter, aber achten Sie darauf, die Säule nicht trocken laufen zu lassen. Eluieren Sie die Peptide mit 2 Zyklen von 50 μl 0,15 % TFA.
9. Entsalzen Sie die Peptide mit einer C18-Tischspitze (im Wesentlichen eine 200-μl-Pipettenspitze mit zwei C18-Scheiben) und trocknen Sie sie durch Vakuumzentrifugation bis zur Vollständigkeit.

Ergebnisse

Abbildung 1: Experimenteller Überblick.(A) Überblick über den experimentellen Ansatz. Die Proben wurden präpariert, trypsinisiert und mittels Umkehrphasenchromatographie mit hoher pH-Elution in drei Fraktionen fraktioniert. Eine Charge kommerzieller α-diGly-Peptid-Antikörperkügelchen wurde in sechs gleiche Fraktionen aufgeteilt, und die drei Peptidfraktionen wurden dann auf drei der Bead-Fraktionen geladen. Die diGly-Peptide wurden i...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lysyl-Endopeptidase (LysC)	Wako Pure Chemicals	Tel.: 129-02541
NanoLC Ofen	MPI Design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	Nr. L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass Spektrometer	ThermoFisher
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polymer Umkehrphasen-Partikel	Agilent Technologien	Artikel-Nr.: PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Reste Motiv (K-ε-GG) Bausatz	Technologien zur Zellsignalisierung	Artikel-Nr.: 5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Kartusche	Gewässer	WAT036790	Entfernen Sie das tC18-Material aus dem Kartusche vor dem Befüllen der Kartusche mit PLRP-S
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 30970
Tris-Basis	Sigma-Aldrich	Nr. T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	Nr. T5941
Trypsin, TPCK-Behandlung	ThermoFisher	20233