DNA-Synthese-Assay: Eine Technik zur Beurteilung der DNA-Synthese in proliferierenden Zellen durch den Einbau von radioaktivem tritiiertem Thymidin

Zusammenfassung

Quelle: Williams, M. et al. Schneller Nachweis von neurologischen Entwicklungsphänotypen in menschlichen neuralen Vorläuferzellen (NPCs). J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video bestimmen wir die proliferative Kapazität von neuronalen Vorläuferzellen, indem wir den Einbau von radioaktivem Tracer tritiiertem Thymidin in die DNA von Zellen messen. Diese Technik kann verwendet werden, um die Zellproliferation nach der Behandlung mit bestimmten Medikamenten und Wachstumsfaktoren zu untersuchen.

Protokoll

>1. Wartung von NPCs

1. Plättieren Sie NPCs mit einer Dichte von 1,5 Millionen Zellen in eine mit ECM-imitiertem Gel beschichtete Vertiefung, die 2 ml 100%iges Expansionsmedium enthält.
2. Inkubieren Sie NPCs bei 37 °C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO₂.
3. Geben Sie 5 μM ROCK-Inhibitor in das Medium für NPCs bei P3 oder niedriger oder für aufgetaute NPCs, um einen übermäßigen Zelltod zu verhindern. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden, um den ROCK-Inhibitor zu entfernen.
4. Passagezellen alle 4–9 Tage, je nachdem, wann sie zusammenfließen. Zellen gelten als konfluent, wenn sie zu einer dicht gepackten Monoschicht werden, die den gesamten Boden der Schalenoberfläche bedeckt.
5. Plattieren Sie NPCs mit einer Dichte von 1 bis 1,5 Millionen Zellen pro Well einer 6-Well-Platte. Entfernen Sie verbrauchte Medien alle 48 h und ersetzen Sie sie durch 2 ml 100 % Expansionsmedium.

>3. DNA-Synthese-Assay für neuronale Vorläuferzellen

1. 100.000 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte abbilden und in dreifachem Zustand/Zustand bewerten.
2. Geben Sie radioaktives, tritiiertes [³H]-Thymidin in das Kulturmedium (1,5 μCi/ml) in jeder Vertiefung nach 46 Stunden Kulturzeit. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2 h.
   Anmerkung: Wenn Sie radioaktive Materialien verwenden, sollten Sie von Ihrer Institution geschult werden, befolgen Sie die Sicherheitsprotokolle für Radioaktivität und entsorgen Sie radioaktive Materialien in den entsprechend dafür vorgesehenen Abfallbehältern.
3. Radioaktive Medien nach 2 h entfernen und ordnungsgemäß entsorgen. 300 μl vorgewärmtes 0,25 %iges Trypsin-EDTA (0,5 mM) in jede Vertiefung geben und 20 Minuten bei 37 °C inkubieren.
4. Schalten Sie den Zellharvester (siehe Abschnitt Materialien) und die Pumpe ein und stellen Sie sicher, dass der Pumpendruck unter 200 PSI liegt. Legen Sie Filterpapier durch den Raum im Cell Harvester und reißen Sie die rechte Ecke ab, um die Papierausrichtung zu markieren.
5. Legen Sie die Auffangröhrchen des Zellernters in eine leere "leere" Schale und drücken Sie auf Vorwäsche, um das Filterpapier zu befeuchten. Setzen Sie die Sammelröhrchen in die Probenvertiefungen ein und führen Sie sie aus (Start).
6. Wenn der Zellensammler mit der Probenentnahme fertig ist, heben Sie die Klemme an und schieben Sie das Filterpapier vor, um den Vorgang für alle Probensätze zu wiederholen. Vorwäsche immer in einer leeren, "leeren" Platte.
7. Trocknen Sie das Filterpapier unter einer Lichtquelle und stellen Sie die entsprechenden Fläschchen in eine Schale. Stanzen Sie Papierblätter in Fläschchen aus und geben Sie 2 ml flüssigen Szintillationscocktail in jedes Fläschchen. Verschließen und etikettieren Sie Fläschchen.
8. Die Fläschchen werden mindestens 1 Stunde lang in einem flüssigen Szintillationscocktail inkubiert, bevor die Zählungen pro Minute (CPM) auf einer Szintillationsmaschine abgelesen werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Erweitertes DMEM/F12 Medium	ThermoFischer Scientific	Artikel-Nr.: 12634-010	Komponente aus 100% Expansionsmedium
Neurobasales Medium	ThermoFischer Scientific	21103049
24-Well-Platten	ThermoFischer Scientific	2021-05	Polystyrolplatten: Wird für den NPC-DNA-Synthese-Assay verwendet
Natürliches Maus-Laminin	Invitrogen	Artikel-Nr.: 23017-015	Substrat für Beschichtungsplatten: Wird für die NPC-DNA-Synthese, den S-Phasen-Eintritt und Zellzahl-Assays verwendet
Penicillin/Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Antibiotikum, Bestandteil von Expansionsmedien
2,5% Trypsin (10X)	Gibco	Artikel-Nr.: 15090-046	10X enzymatische Lösung
0,5 M EDTA	ThermoFischer Scientific	AM9261	Wird in Trypsinlösung zum Heben von Zellen für den DNA-Synthese-Assay verwendet
tritiiertes [3H]-Thymidin	PerkinElmer	NET027E001	Radioaktives Tritium, Thymidin
Fisherbrand 7 mL HDPE-Szintillationsfläschchen	Fisherbrand	Tel.: 03-337-1	Fläschchen für die Flüssigszintillationszählung
EcoLite(+)	MP Biomedizin	188247501	Flüssiger Szintillationscocktail
LS 6500 Mehrzweck-Flüssigszintillationszähler	Beckman Coulter	Tel.: 8043-30-1194	Flüssiger Szintillationszähler
Skatron Semi-automatische Zellerntemaschine	Molecular Devices und Skatron Instruments, Inc.	Typ 11019	Halbautomatische Zellerntemaschine
Filterpapier der Güteklasse GF/C, Whatman	GE Healthcare Life Sciences	Nr. 1822-849	Glasfaser-Filterpapier