NPC Neurosphere Assay: Ein in vitro Assay zur Beurteilung der Migrationsreaktion von neuralen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre

Zusammenfassung

Quelle: Williams, M. et al. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs).J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert den Neurosphären-Migrationsassay für neuronale Vorläuferzellen – ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Migrationsreaktion von neuronalen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre – mittels mikroskopischer Analyse.

Protokoll

>1. NPC-Neurosphären-Migrations-Assay

1. Bildung von Neurosphären
   1. Geben Sie 1 ml 100 % Expansionsmedium in eine 35-mm-Schale ohne Beschichtungssubstrat. Inkubieren Sie die Schalen mindestens 15 Minuten lang bei 37 °C, bevor Sie die NPCs anrichten. Bereiten Sie 2-3 Schalen vor, um sicherzustellen, dass genügend Neurosphären für den Zellmigrationsassay vorhanden sind.
      Anmerkung: Das Fehlen eines Beschichtungssubstrats stellt sicher, dass NPCs im Medium schweben, was für die Bildung von Neurosphären unerlässlich ist. Das Überziehen von Schalen verhindert die Bildung von Neurosphären.
   2. Heben, dissoziieren und pelletieren Sie Zellen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2–5 ml vorgewärmtem 100%-Expansionsmedium. 1 Million NPCs werden in jede 35-mm-Schale, die in Abschnitt 1.1.1 vorbereitet wurde, mit einem Teller gefüllt.
   3. Inkubieren Sie NPCs bei 37 °C für 48 bis 96 Stunden, damit NPCs sich aggregieren und Neurosphären bilden können. Bestimmen Sie die Kugelgröße mit einem Live-Lineal an einem Phasenkontrastmikroskop. Warten Sie, bis die meisten Kugeln einen ungefähren Durchmesser von 100 μm (± 20 μm) erreicht haben (Abbildung 1). Kleinere Kugeln verteilen sich vollständig und brechen während des Migrationsassays auseinander.
2. Vorbereitung von Platten für den Neurosphären-Migrationsassay
   1. Löse ECM-mimische Gelaliquote in 6 ml 30%iges Expansionsmedium auf. Sobald die ECM-imitierte Gel/30%ige Expansionsmedienlösung hergestellt ist, fügen Sie Vehikel, Wachstumsfaktoren oder Arzneimittel von Interesse in den gewünschten Konzentrationen hinzu.
      Anmerkung: Die Konzentrationen von Vehikeln, Medikamenten und Wachstumsfaktoren müssen erhöht werden, um die Hinzufügung von 200 μl Neurosphären in Abschnitt 1.3 zu berücksichtigen.
   2. Platte 1 ml des ECM-Mimikgels / 30%ige Expansionsmedienlösung (± Vehikel, Wachstumsfaktoren oder Medikamente) in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Machen Sie 2–3 Vertiefungen pro Versuchsbedingung. Alternativ können auch 35-mm-Schüsseln verwendet werden. Die Platten mindestens 30 min bei 37 °C inkubieren^.
      Anmerkung: Aspirieren Sie für diesen Assay NICHT das ECM-mimische Gel/die 30%ige Expansionsmedienlösung. Das Plattieren von Kugeln auf ein aspiriertes ECM-Mimic-Gel führt zu einer schnellen und übermäßigen Migration.
3. Neurosphären plattieren
   1. Sammeln Sie die in Abschnitt 1.1 gebildeten Neurosphären und legen Sie sie in eine konische Röhre. Waschen Sie das 35-mm-Geschirr mit 1 ml 1x PBS, um sicherzustellen, dass alle Neurosphären gesammelt werden. Schleudern Sie die gesammelten Neurosphären bei 100 x g für 5 min herunter.
   2. Resuspendieren Sie die Neurosphären in 1–3 ml vorgewärmtem 30%igem Expansionsmedium. Wenn 1 Schale mit Neurosphären entnommen wird, wird 1 ml Medium verwendet, um die Kugeln zu resuspendieren. Wenn 2 Schalen aufgefangen werden, werden 2 ml Medium hinzugefügt, um die Kugeln zu resuspendieren usw. Pipettieren Sie vorsichtig und verwenden Sie nur einen P-1000, um sicherzustellen, dass die Kugeln nicht zerbrochen werden.
   3. Platte 200 μL der resuspendierten Neurosphären in das in Abschnitt 1.2 hergestellte ECM-mimische Gel/30%ige Expansionslösung. Gesteinsplatten in alle Richtungen, um die Neurosphären gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei 37°C.
   4. Entfernen Sie das ECM-mimische Gel/die 30%ige Expansionsmedienlösung und fixieren Sie die Zellen in 4% PFA, waschen und halten Sie die Zellen in 1x PBS + 0,05% Natriumazid.
4. Analyse von Neurosphären
   1. Erfassen Sie Bilder ganzer Neurosphären mit Phasenkontrasteinstellungen bei 10X. Stellen Sie sicher, dass sich die Kugeln nicht berühren. Messen Sie die durchschnittliche Migration mit der ImageJ-Software.
   2. Zeichnen Sie die äußere Kontur der Neurosphäre mit dem Freihandlinienwerkzeug nach. Die Freihandlinie kann durch einen Rechtsklick auf das Symbol der "geraden" Linie aufgerufen werden. Verfolgen Sie manuell mit einer Maus.
   3. Verwenden Sie die Funktion "Messen", um die Fläche der Spur zu berechnen. Stellen Sie sicher, dass "Bereich" als Anzeige im Fenster "Messungen einstellen" auf der Registerkarte "Analysieren" ausgewählt ist. Siehe Abbildung 2 für die Spur der Außenkontur in blau.
   4. Verfolgen Sie die innere Zellmasse der Kugel und messen Sie die Fläche. Siehe Abbildung 2 für die Spur der Innenkontur in rot. Quantifizieren Sie die durchschnittliche Migration, indem Sie die innere Zellmasse von der gesamten Neurosphärenfläche subtrahieren.
   5. Messen Sie Neurosphären, die eine dicht gepackte innere Zellmasse aufweisen, wobei die Zellen als zusammenhängender Teppich auswandern (Abbildung 2).
   6. Schließen Sie keine Zellen außerhalb des Teppichs oder losgelöst von der Neurosphäre für die Messung ein. In Abbildung 2 finden Sie Beispiele für Zellen (weiß eingekreist), die von der Messung des äußeren Teppichs ausgeschlossen sind. Analysieren Sie mindestens 20 Neurosphären für jede Erkrankung.

Ergebnisse

Abbildung 1: Auswahl von Neurosphären für den Migrationsassay. (A) Phasenkontrastbild eines repräsentativen Neurosphärenfeldes nach 24 Stunden. Die Kugeln sind alle kleiner als 100 μm und werden daher nicht für den Migrationsassay gesammelt. (B) Phasenkontrastbild eines repräsentativen Feldes von Neurosphären bei 72 h. Alle Kugeln liegen im Bereich von 100 μm ± 20 μm, was bedeutet, dass sie bereit si...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Neurobasales Medium	ThermoFischer Scientific	21103049	Bestandteil sowohl aus NIM als auch aus 100% Expansionsmedium
PSC Neural Induction Medium: Protokoll Link: https://goo.gl/ euub7a	ThermoFischer Scientific	A1647801	Dies ist ein Kit, das aus neurobasalem (NB) Medium und einem 50x Neural Induction Supplement (NIS) besteht. Das NIS wird verwendet, um 1X Neural Induction Medium und 100% Expansion Medium herzustellen
Erweitertes DMEM/F12 Medium	ThermoFischer Scientific	Artikel-Nr.: 12634-010	Komponente aus 100% Expansionsmedium
hESC-qualifiziertes Matrigel	Corning	354277	hESC-qualifiziertes extrazelluläres Matrix-Mimik-Gel (ECM-Mimik-Gel)
6-Well-Platten	Corning	COR-3506	Polystyrolplatten für die NPC-Wartung und für den Neurosphären-Migrations-Assay
Menschliches Basic FGF-2	Peprotech	100-18 Mrd.	Wachstumsfaktor
Penicillin/Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Antibiotikum, Bestandteil von NIM, 100% Expansion und 30% Expansion Medien