Astrozytenisolierung: Eine Methode zur reinen Präparation von kortikalen Astrozyten der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Schildge, S. et al. Isolierung und Kultur von kortikalen Astrozyten der Maus. J. Vis. Exp. (2013)

In diesem Video beschreiben wir die Methode, um ein reines Präparat von Astrozyten aus neugeborenen Mäusen zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Isolierung und Beschichtung von gemischten kortikalen Zellen

Die Isolierung gemischter kortikaler Zellen für Astrozytenkulturen kann mit P1 bis P4 Maus-Welpen durchgeführt werden. Um die richtige Astrozytendichte zu erreichen, ist es notwendig, 4 Maus-Welpenkortiken pro T75-Gewebekulturflasche zu verwenden. Daher werden die Volumina im folgenden Protokoll für eine Zellpräparation mit 4 Maus-Welpen berechnet.

1. Vor Beginn des Dissektionsverfahrens 30 ml Astrozyten-Kulturmedien (DMEM, hoher Glukosegehalt + 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum + 1 % Penicillin/Streptomycin; siehe Tabelle) auf 37 °C vorwärmen. Ein T75-Kolben mit 20 ml Poly-D-Lysin (PDL) in einer Konzentration von 50 μg/ml in Wasser in Zellkulturqualität für 1 Stunde bei 37 °C im CO₂ -Inkubator bestreichen.
2. Bereiten Sie für die Dissektion alle notwendigen Reagenzien und Materialien vor. Sie benötigen eine chirurgische Schere, eine glatte Feinzange, eine Flachpinzette, Papiertücher, einen Abfallbeutel, 70% Ethanol und 2 Präparierschalen (3,5 cm Durchmesser) auf Eis, die mit je 2 ml HBSS gefüllt sind.
3. Halten Sie den Kopf und Hals des Mäusewelpen vorsichtig fest und besprühen Sie ihn mit 70% Ethanol. Das Tier wird durch Enthauptung mit einer Schere geopfert.
4. Führen Sie einen Schnitt in der Mittellinie von hinten nach vorne entlang der Kopfhaut durch, um den Schädel freizulegen.
5. Schneiden Sie den Schädel vorsichtig vom Hals bis zur Nase ab. Zwei weitere Schnitte werden durchgeführt, um einen weiteren Zugang zum Gehirn zu ermöglichen: Der erste Schnitt wird vor den Riechkolben gemacht, der andere unterhalb des Kleinhirns, um den Schädel von der Schädelbasis zu lösen.
6. Mit der Flachpinzette werden die Schädellappen vorsichtig zur Seite geklappt und das Gehirn herausgenommen und in die erste mit HBSS gefüllte Präparierschale gelegt. Stelle die Schale wieder auf Eis und fahre mit der Ernte aller 4 Gehirne fort.
7. Der Rest der Dissektion wird unter einem Stereomikroskop durchgeführt. Zunächst werden die Riechkolben und das Kleinhirn mit der feinen Präparierzange entfernt (Abbildung 1B).
8. Um die Rinde zu entnehmen, greifen Sie mit der feinen Pinzette nach dem hinteren Ende des Gehirns, führen Sie einen Mittellinienschnitt zwischen den Hemisphären durch, führen Sie eine zweite Pinzette in den entstandenen Hain ein und schälen Sie die plattenartige Struktur der Rinde vom Gehirn ab.
9. Präparieren Sie vorsichtig die Hirnhäute von den Hemisphären der Rinde, indem Sie mit der feinen Pinzette ziehen (Abbildung 1D'). Dieser Schritt vermeidet eine Kontamination der endgültigen Astrozytenkultur durch Meningealzellen und Fibroblasten. Übertragen Sie die vorbereiteten Kortex-Hemisphären in die zweite mit HBSS gefüllte Schale und legen Sie sie wieder auf Eis. Fahre entsprechend mit allen 4 Kortikalen fort.
10. Schneiden Sie zum Schluss jede Hemisphäre der Rinde mit scharfen Klingen in kleine Stücke (ca. 4 bis 8 Mal).
11. Übertragen Sie unter sterilen Bedingungen Cortex-Stücke in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen und fügen Sie HBSS zu einem Gesamtvolumen von 22,5 mL hinzu.
12. 2,5 ml 2,5 % Trypsin zugeben, mischen und das Gewebe im Wasserbad bei 37 °C für 30 min inkubieren. Mischen durch gelegentliches Schütteln alle 10 min.
13. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300 x g, um Cortex-Gewebestücke zu pelletieren.
14. Überstand vorsichtig durch Dekantieren entfernen. Um den Verlust des Gewebepellets zu vermeiden, können Sie es mit einer Pipette mechanisch zurückhalten. Dissoziieren Sie das Gewebe in eine Einzelzellsuspension, indem Sie 10 ml Astrozyten-Plattierungsmedium hinzufügen und mit einer 10-ml-Kunststoffpipette kräftig pipettieren, bis die Gewebestücke in einzelne Zellen dissoziiert sind (20 bis 30 Mal). Stellen Sie das Volumen mit Astrozyten-Beschichtungsmedium auf 20 mL ein. Sie können die Dissoziation des Kortexgewebes in einzelne Zellen durch Zählung mit einem Hämatozytometer nachweisen. Eine Präparation von 4 Maus-Welpenkortiken sollte 10–15 x10⁶ dissoziierte Einzelzellen ergeben.
15. PDL aus dem Kulturkolben T75 aspirieren, die dissoziierte Einzelzellsuspension plattieren und bei 37 °C im CO₂ -Inkubator inkubieren.

>2. Gewinnung einer angereicherten Astrozytenkultur

1. Wechseln Sie das Medium 2 Tage nach der Beschichtung der gemischten kortikalen Zellen und alle 3 Tage danach.
2. Nach 7 bis 8 Tagen, wenn die Astrozyten konfluent sind und die überlagernden Mikroglia auf der Astrozytenschicht freiliegen oder bereits von der Astrozytenschicht gelöst sind (Abbildung 2), schütteln Sie den T75-Kolben bei 180 U/min für 30 Minuten auf einem Orbitalschüttler, um Mikroglia zu entfernen. Entsorgen Sie den Überstand, der Mikroglia enthält, oder wenn Sie Mikroglia kultivieren und untersuchen möchten, schleudern Sie ihn herunter und verlegen Sie ihn für die Kultur.
3. Geben Sie 20 ml frisches Astrozyten-Kulturmedium hinzu und schütteln Sie den Kolben 6 Stunden lang bei 240 U/min, um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) zu entfernen. Da sich einige OPCs nicht vollständig von der Astrozytenschicht lösen, schütteln Sie 1 min lang kräftig mit der Hand, um eine OPC-Kontamination zu vermeiden. Entsorgen Sie den Überstand oder schleudern Sie ihn herunter und plattieren Sie, wenn Sie OPCs kultivieren möchten.
4. Spülen Sie die verbleibende konfluente Astrozytenschicht zweimal mit PBS, aspirieren Sie das PBS, fügen Sie 5 ml Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie im CO₂ -Inkubator bei 37 °C. Überprüfen Sie die Ablösung der Astrozyten alle 5 Minuten und erzwingen Sie die Ablösung der Astrozyten, indem Sie den Kolben gegen die Handfläche schlagen (2-3 Mal).
5. Nachdem die Astrozyten aus dem Kulturkolben gelöst wurden, werden 5 ml Astrozyten-Nährmedium zugegeben, die Zellen 5 Minuten lang bei 180 x g gedreht, der Überstand aspiriert und 40 ml frisches Astrozyten-Beschichtungsmedium zugegeben. Ein T75-Gewebekulturkolben sollte nach der ersten Zellteilung etwa 1x10⁶ Zellen ergeben. Plattenzellen in zwei T75-Kulturkolben geben und bei 37 °C im CO₂ -Inkubator inkubieren. Wechseln Sie das Medium alle 2 bis 3 Tage.
6. 12–14 Tage nach der ersten Spaltung werden die Astrozyten 24–48 Stunden vor der Durchführung des Experiments in der entsprechenden Zellkonzentration plattiert. Ein T75-Gewebekulturkolben sollte nach der zweiten Zellteilung etwa 1,5–2 x 10⁶ Zellen ergeben.

Ergebnisse

Abbildung 1. Dissektion der postnatalen (P3) Hirnrinde. A) Gesamtes Gehirn. B) Gehirn nach Entfernung von Riechkolben und Kleinhirn. C) Isolierung des Kortex durch Ablösen der plattenartigen Struktur des Kortex vom Gehirn. D, D') Kortex von ventraler und dorsaler Stelle mit Hirnhäuten (schwarze Pfeile zeigen die Hirnhautarterien). E) Kortex ohne Hirnhäute. Maßstabsleiste, 1,5 mm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nährmedien für Astrozyten
DMEM mit hohem Glukosegehalt	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 31966-021
FBS hitzeinaktiviert	Lebenstechnologien	Nr. 10082-147	Endkonzentration: 10%
Penicillin-Streptomycin	Lebenstechnologien	Nr. 15140-122	Endkonzentration: 1%
Lösung für die Verdauung von Hirngewebe
HBSS	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 14170-088
2,5% Trypsin	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 15090-046	Endkonzentration: 0,25%
andere
70 % (vol/vol) Ethanol	Roth	9065.2
Poly-D-Lysin	Millipor A-003	A-003-E
Wasser	PAA	Nr. S15-012	Qualität von Zellkulturen
Pbs	PAA	Nr. H15-002	Qualität von Zellkulturen
0,05 % Trypsin-EDTA	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 25300-062
0,45 μm Sterilfilter	Schneidermuskel	Artikel-Nr.: 16555
3,5 cm Petrischale	BD Falke	353001
15 ml Falcon Tube	BD Falke	352096
50 ml Falcon Tube	BD Falke	Artikel-Nr.: 352070
75 cm2 Gewebekultur-Kolben	BD Falke	353136
Pinzette fein	Dumont	2-1032; 2-1033	#3c; #5
Pinzette mit flacher Spitze	KLS Martin	Artikel-Nr.: 12-120-11
13 cm OP-Schere	Äskulap	BC-140-R
stereomikroskop	Leica		MZ7.5
Stereomikroskop + Kamera	Leica		MZ16F; DFC320
Mikroskop + Kamera	Zeiss; Kanon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Zentrifuge	Eppendorf	Artikel-Nr.: 5805000.017	Zentrifuge5804R
Orbitalschüttler	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Wasserbad	Julabo		SW20; 37 °C

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