Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Isolierung von Mikrogefäßen im Gehirn von Ratten
- Verwenden Sie für jedes Präparat und für einen Experimentator 3 fünf Wochen alte Wistar-Ratten.
- Am Montag der ersten Woche werden 2 T75-Kolben vorbereitet, indem sie mit Kollagen Typ IV und Fibronektin, beide in einer Dosis von 1 μg/cm2 in sterilem Kulturwasser (10 ml pro T75), beschichtet werden. Bei 37 °C bis zur Aussaat der Mikrogefäße haften lassen.
Am - Mittwochmorgen der ersten Woche werden die Ratten unter zunehmendem CO2 -Fluss eingeschläfert, um Schläfrigkeit, Haltungsverlust und Atemaussetzer auszulösen, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Besprühen Sie die Köpfe mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Köpfe mit einer Schere ab und geben Sie sie in eine trockene Petrischale unter einer Laminar-Flow-Haube.
- Entnehmen Sie das Gehirn ohne Kleinhirn und Sehnerven aus dem Schädel und geben Sie es dann in eine auf Eis gekühlte Petrischale, die mit Kaltdissektionspuffer gefüllt ist (HBSS ergänzt mit 1% BSA, Penicillin 100 Einheiten/ml und Streptomycin 100 μg/ml).
- Schneiden Sie das Gehirn in zwei Hälften, um die 2 Gehirnhälften zu trennen und das Mittelhirn vom Vorderhirn zu trennen. Übertragen Sie das Vorderhirn in eine saubere Petrischale auf Eis mit Dissektionspuffer.
- Nehmen Sie ein paar Hemisphären in eine neue Petrischale mit Kaltdissektionspuffer, um die Hirnhäute vorsichtig aus dem Vorderhirn unter einem Stereomikroskop mit einer gekrümmten Pinzette Nr. 5 zu entfernen. Reinigen Sie dann das Innere des Gehirns, um die Bettdecke von Myelin zu entfernen und eine Hülle aus Kortex zu erhalten. Diese Schritte sollten nicht länger als 2 Stunden dauern, um das Gewebe zu erhalten und das Überleben der Zellen zu gewährleisten.
- Dissoziieren Sie den Kortex von 3 Gehirnen in 6 mL Kaltdissektionspuffer in einem 7 mL Dounce-Homogenisator durch 10 Auf- und Ab-Hübe mit jeweils 2 Stößeln unterschiedlicher Clearance, 71 μm, gefolgt von 20 μm.
- Die Suspension wird geteilt, um das Äquivalent von 1 Kortex in 1 ml eines 50-ml-Falcon-Röhrchens zu erhalten, und bei 1.000 x g für 5 min bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
- Verdauen Sie die Suspension aus 1 Kortex mit 1 ml einer enzymatischen Lösung, die eine Mischung aus Kollagenasen/Dispase (60 μg/ml–0,3 U/ml), DNase Typ I (35 μg/ml–20 K Einheiten/ml) und Gentamicin (50 μg/ml) in einem Shaker für 30 min bei 37 °C enthält.
- Mischen Sie den 1 ml-Aufschluss aus 1 Kortex mit 10 mL 25 % BSA/HBSS 1X und trennen Sie ihn durch dichteabhängige Zentrifugation bei 3.600 x g für 15 min bei RT. Übertragen Sie die obere Scheibe (Myelin und Hirnparenchym) und den Überstand vorsichtig in ein sauberes 50-ml-Falcon-Röhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation. Halten Sie das resultierende Pellet, das die Mikrogefäße des Gehirns enthält, bei 4 °C.
- Entsorgen Sie vorsichtig die obere Scheibe und den Überstand. Beide resultierenden Pellets, die die Mikrogefäße des Gehirns enthalten, werden mit 1 ml kaltem HBSS 1X resuspendiert und in ein sauberes 50 mL Falcon-Röhrchen überführt.
- Die Mikrogefäße durch Zugabe von 20 mL kaltem HBSS 1X waschen und bei 1.000 x g 5 min zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Ferner werden die Mikrogefäße aus 1 Kortex mit 1 ml der gleichen enzymatischen Lösung, wie in Schritt 1.9 beschrieben, während 1 Stunde bei 37 °C in einem Schüttler verdaut.
- Mischen Sie dann die verdauten Mikrogefäße aus jedem der 3 Kortexe in ein Röhrchen und trennen Sie es weiter in zwei 50-ml-Falcon-Röhrchen, um Mikrogefäße zu erhalten, die aus dem Äquivalent von eineinhalb (1,5) Kortex pro Röhrchen extrahiert wurden. Fügen Sie 30 mL Kaltdissektionspuffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren Sie das Mikrogefäß-Pellet in 10 ml DMEM/F12, ergänzt mit 20 % Rinderplättchenarmem Plasmaserum, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 2 ng/ml), Heparin (100 μg/ml), Gentamicin (50 μg/ml) und HEPES (2,5 mM), genanntem Endothelzellmedium (ECM), ergänzt mit Puromycin in einer Menge von 4 μg/ml.
- Nehmen Sie die 2 beschichteten T75-Kolben aus dem Inkubator, saugen Sie den Überschuss der Beschichtung ab und plattieren Sie die Mikrogefäße aus jedem Röhrchen in einem T75-Kolben (Mikrogefäße, die aus 1,5 Kortex pro T75-Kolben extrahiert werden).
