Blut-Hirn-Tumor-Schranke oder BBTB-Modell: Eine Anpassung des Blut-Hirn-Schranken- oder BHS-Modells zur Bewertung der Verabreichung von Therapeutika an den Tumor

Zusammenfassung

Quelle: Le Joncour, V. et al. Vorhersage der In-vivo-Nutzlastabgabe unter Verwendung einer Blut-Hirn-Tumor-Schranke in einer Schale. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video beschreiben wir ein umfassendes Protokoll zur Etablierung eines In-vitro-Modells, das die Blut-Hirn-Tumor-Schranke nachahmt. Das Modell verspricht, die Verabreichung von Therapeutika für die Behandlung von Hirntumoren zu verstehen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Einrichtung der BBTB Mimics

HINWEIS: Zellkulturmedium und Nahrungsergänzungsmittel sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von Astrozyten
   Anmerkung: Die folgenden Volumina sind für eine 10 cm Petrischale oder einen T75-Zellkulturkolben geeignet.
   1. Waschen Sie die kultivierten Astrozyten unter einer sterilen Zellkulturhaube vorsichtig mit 5 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entsorgen Sie das PBS vorsichtig mit einer Vakuumpumpe und fügen Sie 5 Minuten lang 2 ml des Zelldissoziationsreagenzes hinzu (bei 37 °C, siehe Materialtabelle), um die Zellen zu lösen. Überprüfen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Inkubation, um die Belastung der Zellen zu begrenzen.
   2. Geben Sie 10 ml steriles vollständiges Astrozytenzellkulturmedium (ABM+) in das Gefäß, um die Aktivität des Zelldissoziationsreagenzes zu hemmen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um die abgelösten Zellen aus dem Gefäß in ein steriles 15-ml-Röhrchen zu übertragen. Die Zellsuspension wird 3 min lang bei 250 rcf (Beschleunigung: 9 rcf/s, Verzögerung: 5 rcf/s) bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
   3. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Einsätze vor (siehe Materialtabelle): Platzieren Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette mit der Gehirnseite nach oben (Abbildung 1A) auf dem Deckel einer sterilen 6-Well-Platte (Abbildung 1B). Vergewissern Sie sich vorher, dass die Platte kopfüber auf die Einsätze gelegt werden kann, ohne die Einsätze während des Vorgangs zu berühren oder zu bewegen.
      HINWEIS: Die richtige Platzierung der Einsätze ermöglicht das Einklemmen der Astrozytensuspension zwischen der Membran und dem Boden der Vertiefung.
   4. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aus der Zellsuspension entfernen; resuspendieren Sie das Astrozyten-Pellet in 1 mL ABM+, indem Sie das Pellet vorsichtig bis zu 5x an der Wand des Röhrchens resuspendieren. Vermeiden Sie übermäßiges Pipettieren der Zellen, um die Belastung der Zellen zu begrenzen. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 1,5 x 10⁵ Zellen in 400 μl ABM+/Einsatz ein.
   5. Platzieren Sie die Zellsuspension in der Mitte der Gehirnseite der Membran des Einsatzes (Abbildung 1B) und verteilen Sie sie sehr vorsichtig mit Kapillarkraft mit einer sterilen Pipettenspitze. Vermeiden Sie direkten Kontakt, da die Membran besonders zerbrechlich ist.
   6. Setzen Sie die 6-Well-Platte mit der Gehirnseite der Einsätze wieder auf die Einsätze ein. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellsuspension zwischen der Membran und dem eigentlichen Boden des Wells eingeschlossen ist (Abbildung 1C). Vermeiden Sie Luftblasen in der Zellsuspension, da dies die homogene Ausbreitung der Astrozyten auf der Membran verhindert.
   7. Legen Sie die Platte und die Inserts mit der Gehirnseite nach oben in den Inkubator (bei 37 °C mit 5 % CO₂), um die Zelladhäsion für mindestens 2 h (murine immortalisierte Astrozyten) und bis zu 6 h (humane primäre Astrozyten) zu ermöglichen.
      HINWEIS: Da die Einsätze auf dem Kopf stehend gehalten werden, ist eine Visualisierung der Zelladhäsion unter dem Mikroskop nicht möglich. Es wird daher empfohlen, ein separates reguläres Zellkulturgefäß zu säen und die Zelladhäsion im Gefäß im Laufe der Zeit zu kontrollieren. Eine sorgfältige Manipulation der Membran ist ein Muss, da die Ergebnisse unzuverlässig sind, wenn die Membranen beschädigt werden.
   8. Vergewissern Sie sich am Ende der Inkubationszeit, dass außerhalb des Aussaatbereichs keine Zellsuspensionslecks vorhanden sind, und entsorgen Sie die Einsätze, wenn sie undicht sind. Bringen Sie die 6-Well-Platte wieder in ihre normale Position, mit Einsätzen, die nun mit der Blutseite nach oben zeigen (Abbildung 1A). Geben Sie 2,6 ml ABM+ in jede Vertiefung. Gießen Sie 2,5 ml vollständiges Astrozytenmedium in jeden Einsatz und stellen Sie die Platte in den Inkubator (bei 37 °C mit 5 % CO₂).

>2. Präparation von Endothelzellen

HINWEIS: Für die mikrovaskulären Endothelzellen des murinen Gehirns (bEND3) müssen die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreichen, um maximale Zell-Zell-Kontakte zu gewährleisten, die am Tag des Experiments die optimale Tight-Junction-Proteinexpression auslösen. Dies gilt nicht für die humanen Nabelvenendothelzellen (HuAR2T), da die Anwesenheit von Astrozyten für eine Tight-Junction-Proteinexpression für diese Zellen erforderlich ist.

1. Gehen Sie wie zuvor beschrieben bei den Astrozyten für die Zelldissoziation vor. Nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig entsorgen; Resuspendieren Sie das Endothelzellpellet in 1 ml vollständigem Endothelzellkulturmedium (EBM+), indem Sie die Zellsuspension langsam bis zu 5x an der Wand des Röhrchens pipettieren. Vermeiden Sie übermäßiges Pipettieren der Zellen, um die Belastung der Zellen zu begrenzen. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zellsuspensionsdichte auf 2 x 10⁵ Zellen in 2,5 ml/Einsatz Endothelzellkulturmedium ohne Serum (EBM-) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-A (VEGF-A) ein.
2. Nehmen Sie die Platte mit den Einsätzen heraus, entsorgen Sie das Medium vorsichtig von der Blutseite und ersetzen Sie es durch 2,5 ml der Endothelzellsuspension. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator (bei 37 °C mit 5 % CO₂) und lassen Sie sie über Nacht stehen, damit die Endothelzellen an der Membran haften können.
3. Bereiten Sie am nächsten Tag eine sterile 6-Well-Platte vor, indem Sie 3 ml vorgewärmtes serumfreies Astrozytenmedium (ABM-) in jede Vertiefung geben. Indem Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette anfassen, entsorgen Sie vorsichtig das endotheliale Vollmedium von der Blutseite, setzen Sie den Einsatz in die neue Platte mit ABM- und fügen Sie 2,5 ml EBM-.
   hinzu Anmerkung: Die Verwendung von EBM- ist entscheidend für die Etablierung der Endothelbarriere.
4. Lassen Sie die Einsätze 5 Tage lang im Inkubator (bei 37 °C mit 5 % CO₂) mit minimaler physikalischer Störung und Temperaturschwankungen, so dass die Produktion der endothelialen Basalmembran, der Kontakt der Astrozyten mit den Endothelzellen und schließlich die BHTB-Nachahmungsbildung möglich ist. Ersetzen Sie das Medium am Tag des Transfers auf Gliom-Zellkulturen.

>3. Präparation von Gliomzellen

HINWEIS: Obwohl hier von Patienten stammende Glioblastomkugeln verwendet werden, kann das folgende Protokoll leicht für adhärente, kommerziell erhältliche Glioblastomzellen wie U-87MG angepasst werden.

1. Optional können für die Immunfluoreszenzbildgebung bis zu vier runde sterile Borosilikat-Deckgläser (ø 0,9 cm) pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte mit 2 ml Poly-D-Lysin (0,01 %) gelegt werden. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
2. In der Zwischenzeit werden die Tumorkugeln vorsichtig mit einer sterilen serologischen Pipette aus dem Zellkulturgefäß in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Tumorkugeln für 3 min bei 250 rcf.
3. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Kugeln vorsichtig in 1 ml bFGF/EGF-freiem (GBM-) Gliomzellmedium und zählen Sie die Zellen. Stellen Sie die Zelldichte auf ca. 10⁴ Kugeln/ml (10⁵ Zellen/ml) in GBM- ein.
4. Entsorgen Sie das Poly-D-Lysin aus den Vertiefungen und spülen Sie diese 3x mit sterilem PBS aus. Besäen Sie die Platte mit 3 ml/Vertiefung der Tumor-Sphäroid-Suspension und übertragen Sie die Einsätze mit dem BHS-Mimik auf die Tumorzellsuspension.
5. Über Nacht inkubieren (bei 37 °C mit 5 % CO₂), um ein Gleichgewicht zwischen der Blut- und der Hirntumorseite des Assays zu ermöglichen. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium auf der Blutseite durch EBM-, ergänzt mit den interessierenden Molekülen/Medikamenten/Nanopartikeln. Die Proben werden im Laufe der Zeit für die direkte Quantifizierung entnommen, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Die Zellen werden zu einem genauen Zeitpunkt für die Fluoreszenzbildgebung fixiert.

Ergebnisse

Abbildung 1: Beschreibung des Blut-Hirn-Tumorschranken-Modells (BBTB).(A) Schematische Darstellung der Positionen der verschiedenen Zelltypen. (B) Illustration der Platzierung des Einsatzes auf der 6-Well-Plattenabdeckung und der Aussaattechnik für die Astrozyten auf der Gehirnseite der Membran des Einsatzes. (C) Illustration der 6-Well-Plattenplatzierung, die die Astrozytenadhäsion ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellen
bEND3	ATCC	CRL-2299	Kultiviert in: DMEM (1 g/l Glukose), ergänzt mit 10 % FBS - 5 ml L-Glutamin und 5 mL Penicillin/Streptomycin
HIFko immortalisierte Maus-Astrozyten	Isoliert im Labor von Dr. Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Kultiviert in: BME-1, ergänzt mit 5 % FBS - 5 mL 1 M HEPES-5 mL 100 mM Natriumpyruvat - 3 g D-Glucose und 5 mL Penicillin/Streptomycin
HuAR2T	Isoliert im Labor von Dr. Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Kultiviert in: EBM-2 mit SupplementMix normale humane primäre Astrozyten Lonza CC-2565 Kultiviert in: ABM mit SingleQuots
Material und Reagenzien
100 mm x17 mm Schale Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 150350
10 mL serologische Pipette	ThermoFisher Scientific	170361
15 mL konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 339650
ABM Basalmedium 500 mL	Lonza	Nr. CC-3187	Für primäre menschliche Astrozyten. ABM+: enthält alle Zusatzstoffe aus der Ergänzungsmischung. ABM-: alle Zusatzstoffe außer rhEGF und FBS
Accutase-Lösung zur Zellablösung	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Ergänzungen und Wachstumsfaktoren	Lonza	Nr. CC-4123
B27 Beilage	Gibco	Artikel-Nr.: 17504-044	Sowohl für GBM+ als auch für - mittel
Basal Medium Eagle	ThermoFisher Scientific	21010046	BME-1
Corning Costar TC-behandelte 6-Well-Platten	Sigma-Aldrich	CLS3506
Corning Transwell Zellkultureinsätze mit Polyestermembran	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-Glukose	Sigma-Aldrich	Nr. G8270	In 50 mL BME-1 und Sterilfilter auflösen, bevor Sie es in das Medium geben
Dulbecco's Modifizierter Eagle's Medium/Nährstoff F-12 Schinken	Gibco	Artikel-Nr.: 21331-020	Spezifisch für die Kultur der von Patienten stammenden Kugeln, die in unserem Labor isoliert werden; Kann bei anderen Gliom-Zelllinien variieren
EBM-2 Wachstum Medium SupplementMix	PromoCell	Nr. C-39216	EBM+: enthält alle Zusatzstoffe aus dem Supplement-Mix. EBM-: alle Additive außer VEGF-A und FBS
Endotheliales Basalmedium 2 (EBM-2)	PromoCell	Nr. C-22211	EBM+: enthält alle Zusatzstoffe aus dem Supplement-Mix. EBM-: alle Additive außer VEGF-A und FBS
Fötales Rinderserum (FBS), qualifiziert, hitzeinaktiviert, EU-zugelassen Herkunft	ThermoFisher Scientific	10500056
Fluorescein-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	Nr. F6377
Greiner CELLSTAR 96 Well Platten	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Schwarze Polystyrol-Vertiefungen mit flachem Boden (mit mikroklarem Boden)
Menzel-Gläser 0,9 cm runde Borosilikat-Deckgläser	Thermo Scientific	10313573
PBS-Tabletten	Medicago	Tel.: 09-9400-100	Eine Tablette pro Liter dH2O; dann die Lösung durch Autoklavieren sterilisieren
Poly-D-Lysin-Hydrobromid	Sigma-Aldrich	Nr. P6407
Rekombinanter humaner EGF	Peprotech	GMP100-15	Für GBM+ medium
Rekombinantes humanes FGF-basisch (154 a.a.)	Peprotech	100-18 Mrd.	Für GBM+ medium

Südamerika